Nanomedycyna w terapii opornych nowotworów – przełom w leczeniu

Czy nanomedycyna rewolucjonizuje leczenie opornych nowotworów?

Nanomedycyna otwiera nowe możliwości w terapii opornych nowotworów poprzez przezwyciężanie mechanizmów oporności na chemioterapię. Mimo postępów w badaniach podstawowych i klinicznych, śmiertelność związana z nowotworami wzrasta na całym świecie. Heterogeniczne i złożone mikrośrodowisko guza wraz z wewnętrznymi i/lub nabytymi mechanizmami oporności na leki, takimi jak zwiększony wypływ leków, naprawa uszkodzeń DNA i aktywacja szlaków przeżyciowych komórek, ograniczają skuteczność leczenia chemioterapeutycznego.

Komórki nowotworowe są wyposażone w złożone ścieżki sygnalizacyjne służące do rozpoznawania i naprawy uszkodzonego DNA. Aktywacja mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) przez białka z rodziny kinaz zależnych od fosfatydyloinozytolu (PIKKs), takie jak ataksja-telangiektazja, Rad3-pokrewne (ATR) i katalityczna podjednostka kinazy białkowej zależnej od DNA (DNA-PKcs), stanowi główną przeszkodę w leczeniu opornych na chemioterapię guzów. Różne badania przedkliniczne wykazały, że hamowanie DDR poprzez modulację autofagii lub inhibicję poli(ADP-rybozy) polimerazy (PARP) może zapewnić lepszą odpowiedź terapeutyczną.

Jak nanocząstki przełamują oporność na chemioterapię?

Nanomedycyna wykazała ogromny potencjał w leczeniu opornych na chemioterapię guzów poprzez zapewnienie lepszego ukierunkowania molekularnego, poprawę farmakokinetyki i zmniejszenie skutków ubocznych. Nanomateriały mogą bezpośrednio atakować DNA lub hamować DDR i uwrażliwiać komórki nowotworowe na chemioterapeutyki w wielolekoopornych guzach. Badania wykazały, że nanocząstki srebra pokryte skrobią wywołują uszkodzenia DNA i apoptozę w komórkach HCT116 (ludzki rak jelita grubego). Podobnie, nanocząstki gemcytabiny zamknięte w poli(kwasie mlekowym-co-glikolowym) (PLGA) zwiększają śmierć komórek w opornych na chemioterapię komórkach PANC1 (ludzki rak trzustki). Nanocząstki TiO₂ mogą uwrażliwiać komórki A549 (ludzki rak płuc) na czynniki genotoksyczne poprzez zakłócenie procesu DDR, a nanocząstki ZnO wywołują znaczącą cytotoksyczność i podwójne pęknięcia nici DNA w komórkach SKOV3 (ludzki rak jajnika) poprzez indukcję stresu oksydacyjnego i modulację autofagii.

Tlenek grafenu (GO) ze względu na swoje unikalne właściwości fizykochemiczne wzbudził ogromne zainteresowanie naukowe jako wydajny nośnik leków i modulator aktywności biologicznej, w tym autofagii, DDR i wewnątrzkomórkowego transportu terapeutyków do komórek nowotworowych. Ekspozycja na GO wykazała zdolność do wywoływania odpowiedzi autofagicznej poprzez receptory toll-podobne w komórkach CT26 (mysie komórki raka jelita grubego) oraz destabilizacji lizosomalnej w komórkach PC12 (komórki guza chromochłonnego nadnerczy szczura), co prowadzi do śmierci komórek. GO wykazał zdolność do uwrażliwiania komórek nowotworowych CT26, Skov-3, HeLa i Tramp-C1 na chemioterapeutyki poprzez zwiększoną acetylację histonu w jądrze, powodując zwiększone rozluźnienie chromatyny i większą podatność komórek nowotworowych na uszkodzenia DNA.

Co więcej, GO wykazał zdolność do selektywnego atakowania komórek macierzystych nowotworów poprzez hamowanie wielu różnych szlaków transdukcji sygnału, w tym WNT, Notch, STAT 1/3 i NRF-2. Arkusze GO selektywnie zakłócają błonę komórkową i cytoszkielet komórek nowotworowych poprzez aktywację szlaku FAK-Rho-ROCK i zahamowanie ekspresji integryny. “Nasze badania wykazały, że ekspozycja na nanokoniugat tlenku grafenu z chlorochiną (GO-Chl) wywołała fragmentację/uszkodzenie DNA w komórkach A549, powodując znaczącą genotoksyczność, która ostatecznie prowadzi do zwiększonej śmierci komórek nowotworowych” – piszą autorzy badania.

Jak zsyntetyzowano i scharakteryzowano nanokoniugat GO-Chl?

Zespół badawczy zbadał mechanizm śmierci komórkowej zależnej od uszkodzenia DNA w komórkach A549 (ludzki rak płuca) po ekspozycji na nanokoniugat GO-Chl. Analiza immunoblotowa biomarkerów autofagii ujawniła związek między autofagią a uszkodzeniem DNA w odpowiedzi na ekspozycję na GO-Chl w komórkach raka nabłonkowego płuc człowieka (A549).

Nanokoniugat GO-Chl został zsyntetyzowany poprzez chemiczną eksfoliację grafitu, a następnie przyłączenie cząsteczek chlorochiny do arkuszy GO poprzez niekowalencyjne oddziaływania π-π między chinoliną chlorochiny a domeną grafitową GO. Proces syntezy GO obejmował chemiczną eksfoliację i utlenianie proszku grafitowego z użyciem mieszaniny NaNO₃ i H₂SO₄, do której powoli dodawano KMnO₄, a reakcję utleniania zatrzymywano przez dodanie H₂O₂ i ultraczystej wody. Oczyszczone arkusze grafitowe zbierano za pomocą kolejnych etapów wirowania i przemywania wodą dejonizowaną.

Dokładna charakterystyka fizykochemiczna potwierdziła skuteczne tworzenie nanokoniugatu GO-Chl z wysoką wydajnością enkapsulacji (88,49%) i efektywnością ładowania leku (6,637%). Analiza spektroskopowa UV-vis wykazała charakterystyczne pasma przy około 230 nm i 295 nm dla GO, odpowiadające przejściom elektronowym π-π\* i n-π\*. Obecność charakterystycznego pasma Chl przy około 343 nm w GO-Chl można powiązać z wiązaniem Chl do GO. Analiza FTIR ujawniła obecność charakterystycznych pasm dla GO, takich jak rozciąganie wiązań -OH (3200-3400 cm⁻¹), C=O (1720 cm⁻¹), C=C (1620 cm⁻¹), C-OH (1150 cm⁻¹) i C(O)C (1050 cm⁻¹), a także pasma charakterystyczne dla Chl, takie jak rozciąganie C-H grupy metylowej (2980 cm⁻¹), rozciąganie C-N (1360 cm⁻¹) i rozciąganie C-Cl (530 cm⁻¹).

Spektroskopia Ramana wykazała obecność pasma G (1581 cm⁻¹) i pasma D (1352 cm⁻¹) dla grafitu, a także przesunięcie pasma G (do 1596 cm⁻¹) i zwiększenie stosunku intensywności I₀/I₆ dla GO, co wskazuje na zwiększoną amorfizację grafitową i obecność defektów strukturalnych. Analiza XPS potwierdziła obecność grup funkcyjnych zawierających tlen na powierzchni arkuszy GO oraz obecność grup funkcyjnych związanych z GO i Chl w nanokoniugacie GO-Chl. Analiza morfologiczna za pomocą FESEM i HRTEM wykazała tworzenie się dobrze zdefiniowanej, trójwymiarowej sieci arkuszy GO o wysokiej przezroczystości, co sugeruje tworzenie się pojedynczych lub kilkuwarstwowych arkuszy GO.

Badania internalizacji komórkowej wykazały, że komórki A549 skutecznie pobierają nanokoniugat GO-Chl, co prowadzi do zwiększonej liczby wakuoli obserwowanych w komórkach traktowanych. Analiza przepuszczalności błony komórkowej przeprowadzona za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem jodku propidyny (PI) wykazała zależny od dawki wzrost liczby komórek z naruszoną integralnością błony, co wskazuje na znaczący wzrost liczby martwych komórek A549 po ekspozycji na GO-Chl.

Czy genotoksyczność i autofagia są kluczem do skutecznej terapii?

Czy uszkodzenia DNA odgrywają kluczową rolę w mechanizmie działania przeciwnowotworowego GO-Chl? Aby odpowiedzieć na to pytanie, naukowcy przeprowadzili analizę cyklu komórkowego i ocenę genotoksyczności. Analiza cyklu komórkowego wykazała znaczący wzrost populacji komórek w fazie sub G1 (zmniejszona zawartość DNA), co można przypisać możliwej fragmentacji DNA i ostatecznej śmierci komórek A549 po ekspozycji na nanokoniugat GO-Chl.

Test kometowy (elektroforeza pojedynczych komórek) przeprowadzony w celu oceny genotoksyczności wykazał zależne od dawki uszkodzenie DNA w komórkach A549 po ekspozycji na GO-Chl. Zaobserwowano znaczący wzrost długości ogona, procentowej zawartości DNA w ogonie i momentu ogonowego Olive wraz ze wzrostem stężenia GO-Chl, co potwierdza silne działanie genotoksyczne nanokoniugatu. Niedawne badania wykazały, że ekspozycja na wyższe stężenia GO może indukować uszkodzenia DNA poprzez szlak naprawy przez wycinanie zasad (BER) w komórkach HEK 293T. Obecność wysokiej mobilności i ostrych krawędzi GO może potencjalnie przyczyniać się do zachowania genotoksycznego. Z drugiej strony, Chl wykazała zdolność do wywoływania genotoksyczności w komórkach nowotworowych w sposób zależny od reaktywnych form tlenu (ROS).

Jaki jest związek między autofagią a uszkodzeniem DNA w komórkach nowotworowych? “Nasze wyniki sugerują, że inhibicja autofagii przez GO-Chl odgrywa kluczową rolę w indukcji uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych” – zauważają badacze. Komórki nowotworowe wykorzystują autofagię w odpowiedzi na uszkodzenia DNA jako mechanizm przeżycia, a hamowanie autofagii może być doskonałą metodą leczenia wielolekoopornych guzów. Aby zbadać rolę autofagii w uszkodzeniu DNA, zespół przeprowadził barwienie monodansylkadaweryną (MDC), analizę konfokalną komórek transfekowanych plazmidem GFP-LC3 oraz analizę TEM. Wszystkie te metody wykazały znaczącą akumulację autofagosomów w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl, co sugeruje inhibicję autofagii.

Analiza immunoblotowa kluczowych białek autofagii wykazała znaczący wzrost ekspresji bekliny-1, ATG-7, LC-3-II i SQSTM1/p62 w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl. Podwyższony poziom ekspresji bekliny-1 prowadzi do zwiększonego uszkodzenia DNA w komórkach nowotworowych, co prowadzi do zwiększenia śmierci komórek. Z kolei ATG-7 jest kluczowym białkiem w tworzeniu autofagosomu poprzez wydłużanie błony fagoforu za pośrednictwem aktywacji systemu koniugacji podobnego do ubikwityny (ATG5-ATG12-ATG16L1).

Zaobserwowano również znaczący, zależny od dawki wzrost poziomu ekspresji białek LC-3 II. LC-3 jest białkiem związanym z mikrotubulami 1A/1B – łańcuchem lekkim 3, który ulega lipidacji i ściśle łączy się z błoną autofagosomu. Białka LC-3 są wbudowywane w błonę autofagosomu, która jest później degradowana przez autolizosomy (powstałe przez fuzję autofagosomów i lizosomów). Podwyższona ekspresja biomarkerów LC-3-I/II wskazuje na tworzenie i akumulację autofagosomów i sugeruje modulację procesu autofagii poprzez upośledzony przepływ autofagiczny, częściowo spowodowany przez chlorochinę w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl.

Szczególnie interesujący jest znaczący wzrost ekspresji SQSTM1/p62, który wskazuje na modulację autofagii w późniejszym etapie poprzez hamowanie fuzji autofagosomu z lizosomami. SQSTM1/p62 jest białkiem wielodomenowym, które wchodzi w interakcje z maszynerią autofagii w celu regulacji różnych komórkowych procesów metabolicznych. Niedawne badania wykazały, że substrat autofagii SQSTM1/p62 hamuje ubikwitynację chromatyny zależną od ligazy E3 RNF168 i odgrywa kluczową rolę w dysfunkcji zdolności naprawy DNA poprzez modulację autofagii. Podwyższona ekspresja p62 zaobserwowana w tym badaniu jest zgodna z wcześniej zgłaszanymi danymi, sugerując kluczową rolę maszynerii autofagii w wykorzystaniu odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl.

Czy odkrycia te mogą mieć znaczenie kliniczne? Jak zauważają autorzy, nanokoniugat GO-Chl może indukować uszkodzenia DNA poprzez modulację autofagii zależną od SQSTM1/p62. To odkrycie sugeruje, że GO-Chl może być obiecującym kandydatem na nanolek, samodzielnie lub potencjalnie w połączeniu z innymi lekami chemioterapeutycznymi, poprzez unikalną synergię uszkodzenia DNA i autofagii.

Badanie to dostarcza cennych informacji na temat mechanizmu działania przeciwnowotworowego nanokoniugatu GO-Chl i podkreśla potencjał nanomedycyny w przezwyciężaniu oporności na chemioterapię. Modulacja autofagii w połączeniu z indukcją uszkodzeń DNA może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu opornych na leczenie nowotworów. Czy ten podwójny mechanizm działania może być wykorzystany w terapii innych typów nowotworów? To pytanie wymaga dalszych badań, ale wyniki te otwierają nowe możliwości w projektowaniu nanoleków ukierunkowanych na modulację autofagii i uszkodzenie DNA.

Warto zauważyć, że skuteczność nanomedycyny w dużej mierze zależy od efektywnej internalizacji komórkowej i transportu do odpowiedniego miejsca efektorowego wewnątrzkomórkowego. Badania wykazały, że GO jest internalizowany poprzez endocytozę zależną od klatryny lub kaweoliny oraz mikropinocytozę, w zależności od jego rozmiaru i charakterystyki powierzchni (tj. hydrofilowości lub hydrofobowości oraz stosunku C/O). Ta zdolność do efektywnego wnikania do komórek nowotworowych czyni GO atrakcyjnym nośnikiem dla leków przeciwnowotworowych.

Podsumowując, badanie to z powodzeniem wykazało genotoksyczność indukowaną w komórkach raka płuc A549 przez ekspozycję na nanokoniugat GO-Chl i wyjaśniło rolę modulacji autofagii w hamowaniu odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Analiza cytometryczna PI wykazała znaczną utratę integralności błony komórkowej, co prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego. Ponadto elektroforeza pojedynczych komórek (test kometowy) wykazała znaczący, zależny od dawki wzrost długości ogona, procentu DNA w ogonie i momentu ogonowego Olive jako miary genotoksyczności w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl.

Aby ocenić rolę modulacji autofagii przez nanokoniugat GO-Chl, zespół zastosował barwienie MDC, mikroskopię konfokalną z użyciem komórek transfekowanych GFP-LC3 i analizę TEM. Zaobserwowano znaczącą, zależną od dawki akumulację autofagosomów, co sugeruje hamowanie autofagii i możliwy związek między odpowiedzią na uszkodzenia DNA a autofagią. Wreszcie, podwyższone poziomy ekspresji kluczowych białek autofagii, takich jak beklina-1, ATG-7, LC-3-I/II i SQSTM1/p62, ujawniają, że hamowanie autofagii w późniejszych etapach odgrywa kluczową rolę w regulowaniu zdolności odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach A549 eksponowanych na GO-Chl. Wyniki te ujawniają skuteczność nanokoniugatu GO-Chl jako kandydata na nanolek, samodzielnie lub potencjalnie w połączeniu z innymi lekami chemioterapeutycznymi, poprzez unikalną synergię uszkodzenia DNA i autofagii.

Podsumowanie

Nanomedycyna oferuje przełomowe rozwiązania w leczeniu opornych nowotworów poprzez wykorzystanie nanomateriałów, które mogą przezwyciężać mechanizmy oporności na chemioterapię. Szczególnie obiecujący jest nanokoniugat tlenku grafenu z chlorochiną (GO-Chl), który wykazuje zdolność do indukowania uszkodzeń DNA i modulacji autofagii w komórkach nowotworowych. Badania na komórkach raka płuc A549 potwierdziły, że GO-Chl skutecznie wywołuje genotoksyczność i hamuje autofagię, co prowadzi do śmierci komórek nowotworowych. Wysoka wydajność enkapsulacji (88,49%) i efektywność ładowania leku (6,637%) potwierdzają potencjał tego nanokoniugatu jako nośnika leków. Mechanizm działania opiera się na podwójnym efekcie: bezpośrednim uszkodzeniu DNA oraz modulacji procesu autofagii poprzez wpływ na kluczowe białka, takie jak beklina-1, ATG-7, LC-3-II i SQSTM1/p62. Te odkrycia otwierają nowe możliwości w projektowaniu skutecznych terapii przeciwnowotworowych, szczególnie w przypadku guzów opornych na konwencjonalne metody leczenia.

Bibliografia

Arya Braham Dutt, Mittal Sandeep, Joshi Prachi, Pandey Alok Kumar, Ramirez-Vick Jaime E, Gupta Govind and Singh Surinder P. Graphene oxide–chloroquine conjugate induces DNA damage in A549 lung cancer cells through autophagy modulation. Beilstein Journal of Nanotechnology 2025, 16(20), 316-332. DOI: https://doi.org/10.3762/bjnano.16.24.