Nowe mechanizmy działania chlorochiny w terapii malarii

Jakie dodatkowe mechanizmy działania wykazuje CQ?

Chloroquine (CQ) jest lekiem przeciwmalarycznym stosowanym od lat 40. XX wieku, jednak jego skuteczność w leczeniu zakażeń Plasmodium falciparum stopniowo malała z powodu narastającej oporności pasożytów. Dotychczas uważano, że główny mechanizm działania CQ polega na blokowaniu polimeryzacji hemu do hemozoiny w wakuoli trawiennej pasożyta, co uniemożliwia mu detoksykację. Najnowsze badania ujawniają jednak dodatkowe mechanizmy działania tego leku, które mogą mieć istotne znaczenie kliniczne.

Badacze wykazali, że CQ powoduje permeabilizację błony wakuoli trawiennej pasożyta, co prowadzi do wycieku jonów wapnia do cytoplazmy zakażonej krwinki czerwonej (iRBC). Ten proces inicjuje kaskadę zdarzeń przypominających zaprogramowaną śmierć komórki, obejmującą przepuszczalność zewnętrznej błony mitochondrialnej i degradację DNA. Najnowsze odkrycia wskazują, że zaburzenie homeostazy wapnia w iRBC wywołane przez CQ prowadzi do wystąpienia charakterystycznych cech eryptozy – procesu suicydalnej śmierci krwinek czerwonych.

W badaniu zaobserwowano, że iRBC traktowane CQ wykazują zwiększoną eksternalizację fosfatydyloseryny (PS) na zewnętrznej warstwie błony komórkowej oraz podwyższone stężenie ceramidu. Oba te zjawiska są klasycznymi markerami eryptozy. Analiza wykazała 5,46-krotny wzrost ekspozycji PS w iRBC traktowanych CQ w porównaniu do kontroli, co jest porównywalne z efektem jonoforu wapniowego (5,85-krotny wzrost). Mikroskopia fluorescencyjna wysokiej rozdzielczości potwierdziła te obserwacje, uwidaczniając translokację PS na zewnętrzną warstwę błony komórkowej.

Analiza za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazała, że leczenie CQ powoduje również obkurczenie komórek i tworzenie się pęcherzyków błonowych, co dodatkowo potwierdza indukcję eryptozy. Co istotne, te zmiany morfologiczne były najbardziej nasilone w przypadku stosowania CQ w porównaniu z innymi badanymi związkami przeciwmalarycznymi, takimi jak meflochina (MQ). Ilościowa analiza wykazała znaczący wzrost liczby pęcherzyków na powierzchni iRBC traktowanych CQ, QC i DCB po 10 godzinach inkubacji.

Jak CQ zmienia strukturę i funkcję zakażonych krwinek?

Wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego wywołany przez CQ aktywuje µ-kalpainę – zależną od wapnia proteazę cytoplazmatyczną, która prowadzi do rozkładu cytoszkieletu krwinki czerwonej. Badacze wykazali, że CQ, chinacryna (QC) i 3′,4′-dichlorobenzamil (DCB) – związki zaburzające homeostazę wapnia – powodują aktywację µ-kalpainy i degradację białka KAHRP (knob-associated histidine-rich protein), które jest kluczowe dla integralności cytoszkieletu iRBC. Western blot wykazał, że związki zaburzające wakuolę trawienną (CQ, QC i DCB) prowadziły do pojawienia się podwójnych prążków µ-kalpainy, gdzie forma 80 kDa jest przekształcana w aktywną formę 75 kDa w obecności wapnia. Preinkubacja z chelaterem wapnia BAPTA-AM zapobiegała tym efektom, co potwierdza centralną rolę zaburzeń homeostazy wapnia w mechanizmie działania CQ.

Kolejnym istotnym odkryciem jest charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) uwalnianych przez iRBC w odpowiedzi na leczenie CQ. EVs są strukturami otoczonymi podwójną warstwą lipidową, zawierającymi białka, metabolity, lipidy i kwasy nukleinowe pochodzące zarówno od pasożyta, jak i od komórki gospodarza. Analiza ilościowa i rozkład wielkości EVs za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) wykazały, że niezakażone krwinki czerwone (uRBC) uwalniają głównie mniejsze pęcherzyki (0-500 nm) ze średnią wartością 2,54 x 10¹⁰ cząstek/ml, podczas gdy iRBC traktowane CQ wydzielają większe struktury (500,5-1000 nm) ze średnią wartością 2,80 x 10⁸ cząstek/ml, które mogą odpowiadać ciałom eryptotycznym.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna (TEM) potwierdziła charakterystyczny kształt miseczkowaty EVs i obecność struktur nanocząstkowych otoczonych podwójną warstwą lipidową, o średnim rozmiarze około 200 nm. Western blot wykazał obecność markerów EVs – ALIX i TSG-101 we wszystkich próbkach EVs, przy jednoczesnym braku ApoA1, który stanowił kontrolę negatywną.

Jakie znaczenie kliniczne niosą te odkrycia?

Analiza proteomiczna z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS) oraz spektrometrii mas SWATH-MS ujawniła unikalny profil białkowy EVs pochodzących z iRBC traktowanych CQ. Zaobserwowano znaczące wzbogacenie w podjednostki proteasomu (zarówno ludzkiego, jak i pasożytniczego) oraz białka rybosomalne Plasmodium. Konkretnie, zidentyfikowano 6 ludzkich podjednostek proteasomalnych, 8-13 pasożytniczych podjednostek proteasomu oraz 16-23 pasożytnicze białka rybosomalne, które były znacząco bardziej liczne w EVs z iRBC traktowanych CQ w porównaniu z kontrolą i EVs z iRBC traktowanych MQ.

Analiza szlaków KEGG wykazała nadreprezentację ludzkich białek proteasomalnych w EVs z iRBC nieleczonych, traktowanych CQ i traktowanych MQ, podczas gdy proteasom i rybosom Plasmodium były znacząco wzbogacone tylko w EVs z nieleczonych iRBC i EVs z iRBC traktowanych CQ. Wśród białek pasożytniczych szczególnie obfite było białko rybosomalne P2 kwaśnej podjednostki 60S (P2), które ma silny potencjał immunogenny i może pełnić dodatkowe funkcje poza rybosomalne.

Badacze ocenili również funkcjonalność kompleksów proteasomalnych w EVs, wykazując, że aktywność proteolityczna podobna do chymotrypsyny była znacząco wyższa w kompleksach proteasomalnych EVs pochodzących z iRBC. Następnie zbadano wpływ EVs na inwazję pasożyta oraz na odpowiedź immunologiczną gospodarza. W 32-godzinnym teście inwazji z wykorzystaniem krwinek czerwonych znakowanych Cell Tracker Deep Red (CTDR), wzbogaconych schizontów i różnych próbek EVs, nie zaobserwowano istotnych różnic w tempie wzrostu pasożyta między próbkami EVs a kontrolą.

Natomiast EVs z iRBC traktowanych CQ indukowały produkcję interleukiny-6 (IL-6) przez makrofagi pochodzące z linii komórkowej THP-1, chociaż efekt ten nie był tak silny jak w przypadku lipopolisacharydu (LPS). Poziomy TNF-α i IL-1β nie uległy istotnym zmianom. Analiza transkryptomiczna wykazała, że EVs z nieleczonych uRBC, nieleczonych iRBC i iRBC traktowanych CQ indukowały odpowiednio 23, 125 i 78 różnicowo ekspresjonowanych genów (DEG).

Analiza szlaków Reactome wykazała, że szlaki interleukin były nadreprezentowane wśród DEG dla makrofagów stymulowanych próbkami EVs, podczas gdy sygnalizacja interferonowa i sygnalizacja interferonu alfa/beta były unikalnymi nadreprezentowanymi szlakami po stymulacji EVs z iRBC traktowanych CQ. Analiza KEGG wykazała, że szlak sygnalizacyjny TNF-α, interakcja cytokina-receptor cytokinowy oraz interakcja białka wirusowego z cytokiną i receptorem cytokinowym były nadreprezentowanymi szlakami dla makrofagów stymulowanych próbkami EVs.

Wykazano, że szlak sygnalizacyjny interferonu alfa/beta z szlaków Reactome wykazał 3 geny stymulowane interferonem (ISG) – MX1, IFIT1 i IFITM1 – o zwiększonej ekspresji tylko dla EVs z iRBC traktowanych CQ, podczas gdy interakcja cytokina-receptor cytokinowy z szlaków KEGG wykazała 4, 11 i 8 DEG dla makrofagów stymulowanych odpowiednio EVs z nieleczonych uRBC, nieleczonych iRBC i iRBC traktowanych CQ.

Te odkrycia mają istotne implikacje kliniczne. Po pierwsze, sugerują, że CQ działa nie tylko bezpośrednio na pasożyta, ale również indukuje eryptozę zakażonych krwinek czerwonych, co może stanowić dodatkowy mechanizm eliminacji pasożyta. Po drugie, unikalny profil białkowy EVs uwolnionych w odpowiedzi na leczenie CQ może modulować odpowiedź immunologiczną gospodarza, potencjalnie wpływając na przebieg choroby i skuteczność terapii.

W kontekście narastającej oporności na leki przeciwmalaryczne, lepsze zrozumienie wielopoziomowego działania CQ może pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych. Ukierunkowanie na zaburzenia homeostazy wapnia w iRBC oraz modulowanie uwalniania i składu EVs mogą stanowić obiecujące podejścia w walce z malarią. Dodatkowo, charakterystyczny profil proteomiczny EVs mógłby potencjalnie służyć jako biomarker odpowiedzi na leczenie.

Dalsze badania powinny koncentrować się na dokładniejszym określeniu roli EVs w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz na zbadaniu, czy inne leki przeciwmalaryczne również indukują podobne zmiany w iRBC i ich EVs. Wielopoziomowe zrozumienie działania leków przeciwmalarycznych może prowadzić do optymalizacji istniejących terapii i rozwoju nowych strategii w walce z tą groźną chorobą pasożytniczą, która wciąż stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, szczególnie w regionie afrykańskim WHO, gdzie występuje 93,6% globalnego obciążenia malarią.

Podsumowanie

Najnowsze badania wykazały, że chlorochina (CQ) działa przeciwmalaryczne poprzez kilka mechanizmów. Oprócz znanego blokowania polimeryzacji hemu, lek powoduje permeabilizację błony wakuoli trawiennej pasożyta, prowadząc do wycieku jonów wapnia i indukcji eryptozy w zakażonych krwinkach czerwonych. Proces ten charakteryzuje się eksternalizacją fosfatydyloseryny, wzrostem stężenia ceramidu oraz zmianami morfologicznymi komórek. CQ aktywuje także µ-kalpainę, powodując degradację cytoszkieletu krwinki. Badania wykazały, że zakażone krwinki czerwone pod wpływem CQ uwalniają charakterystyczne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, zawierające unikalne profile białkowe, w tym podjednostki proteasomu i białka rybosomalne Plasmodium. Te pęcherzyki modulują odpowiedź immunologiczną gospodarza, szczególnie poprzez indukcję interleukiny-6 i aktywację szlaków interferonowych. Odkrycia te mają istotne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów oporności na leki przeciwmalaryczne i rozwoju nowych strategii terapeutycznych.