Pęcherzyki pozakomórkowe kluczem do zrozumienia agresji glejaków

Czy GBM ukrywa klucz do agresji poprzez EVs?

Glioblastoma multiforme (GBM) jest najczęstszym i najbardziej agresywnym nowotworem mózgu. Standardowa terapia obejmuje resekcję chirurgiczną, radioterapię oraz chemioterapię temozolomidem (TMZ) – związkiem alkilującym DNA, jednak mimo leczenia nieuchronnie dochodzi do nawrotu guza w miejscu pierwotnym lub jego okolicy. Nowotwory GBM charakteryzują się wysoce heterogennym mikrośrodowiskiem zawierającym zarówno komórki nowotworowe, jak i różne typy komórek nienowotworowych. W złożonych interakcjach wewnątrz guza, które determinują agresywność choroby, istotną rolę odgrywają pęcherzyki pozakomórkowe (EVs).

EVs to otoczone błoną cząsteczki pozbawione funkcjonalnego jądra, występujące w płynach ustrojowych oraz pożywkach hodowlanych. Charakteryzują się znaczną heterogennością wynikającą z różnego pochodzenia wewnątrzkomórkowego i mechanizmów biogenezy, co przekłada się na różnorodność ich rozmiarów, składu i właściwości funkcjonalnych. Funkcjonują jako międzykomórkowe nośniki bioaktywnych cząsteczek, w tym lipidów, białek i kwasów nukleinowych, umożliwiając efektywną komunikację między różnymi typami komórek. Komórki nowotworowe produkują je w dużych ilościach, a EVs są zaangażowane w etiologię i rozwój nowotworów poprzez promowanie angiogenezy, inwazji, unikanie apoptozy oraz oporność na chemioterapię, w tym na TMZ.

Kluczowe odkrycia dotyczące EVs w GBM:

Kombinacja TMZ i CHQ prowadzi do synergistycznego zwiększenia wydzielania pęcherzyków pozakomórkowych (EVs)
EVs zawierają markery autofagii (LC3B-II, p62) oraz markery egzosomów (alix, syntenina-1)
Zaobserwowano znaczącą regulację w górę kaweoliny-1 w małych EVs, co może mieć związek z agresywnością nowotworu
Efekt synergistyczny nie wynika tylko z apoptozy komórek, ale z aktywacji niekonwencjonalnych szlaków wydzielniczych

Jaką rolę odgrywa autofagia w oporności na TMZ?

Autofagia jest procesem katabolicznym, którego kanoniczną funkcją jest degradacja składników wewnątrzkomórkowych, w tym całych organelli w przypadku makroautofagii. Jest indukowana w warunkach stresu i głodzenia, a jej głównym celem jest dostarczanie komórkom składników odżywczych przy jednoczesnej eliminacji potencjalnie cytotoksycznych odpadów wewnątrzkomórkowych, takich jak dysfunkcyjne organelle, agregaty białkowe i uszkodzone DNA. Procesy związane z autofagią są również zaangażowane w niekonwencjonalne szlaki wydzielnicze, w tym biogenezę i wydzielanie EVs.

Badania wskazują na udział autofagii w etiologii GBM i rozwoju oporności na leczenie. Po zatrzymaniu cyklu komórkowego indukowanego przez TMZ, autofagia poprawia żywotność komórek poprzez usuwanie uszkodzonych organelli i białek, a w konsekwencji zmniejszanie stresu komórkowego, co przyczynia się do rozwoju oporności na TMZ. Chlorochina (CHQ), inhibitor późnej fazy autofagii i induktor wydzielania EV, wzmacnia wrażliwość na promieniowanie i zwiększa cytotoksyczność TMZ w złośliwych glejakach poprzez mechanizmy zależne i niezależne od autofagii. Ponadto badania wskazują na aktywność kaspaz oraz szlaki sygnałowe zależne od kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K)/Akt i p53 w zwiększonej przez CHQ cytotoksyczności TMZ.

Czy kombinacja TMZ i CHQ zmienia wydzielanie EV w glejakach?

Ponieważ ciałka apoptotyczne mogą znacząco przyczyniać się do puli EVs, ważnym aspektem analizy tempa aktywnego wydzielania EV jest zbadanie wskaźników apoptozy w określonych warunkach eksperymentalnych. W badaniu wykorzystano dwie linie komórkowe GBM do przetestowania potencjalnych interakcji między TMZ i CHQ w wydzielaniu EV. Komórki U87-MG są znane jako wrażliwe na TMZ, ponieważ nie wykazują ekspresji O6-metylotransferazy metyloguaniny DNA (MGMT). Natomiast komórki U138-MG wykazują ekspresję tego enzymu i są bardziej oporne na TMZ w porównaniu z komórkami, które nie wykazują ekspresji MGMT.

W badaniach in vitro dotyczących EVs zazwyczaj stosuje się pożywkę bezsurowiczą lub pożywkę z niskim (2-5%) stężeniem FBS pozbawionego EVs, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek EVs z surowicy oraz zmniejszyć ilość albuminy i innych białek wiążących lipidy, które wiążą się z EVs. W obecnym badaniu porównano wpływ 10 μM CHQ na cytotoksyczność 400 μM TMZ w hodowlach U87 i U138 po 48 godzinach inkubacji w pożywce z 5% FBS pozbawionym EVs. Stężenia te wybrano na podstawie wcześniejszych doniesień: wartości IC₅₀ TMZ dla komórek U87 wynoszą zazwyczaj ~100-300 μM (24-72 h), podczas gdy komórki U138 są znacznie bardziej odporne, z wartościami IC₅₀ zbliżającymi się do 1 mM. CHQ jest ogólnie cytotoksyczna dla komórek glejaka w stężeniach > 10 μM, ale jest szeroko stosowana w stężeniu 10 μM w badaniach analizujących jej rolę jako inhibitora autofagii i uwrażliwiacza na TMZ.

Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, barwienie PI/aneksyną V-FITC wykazało, że komórki U87 były bardziej wrażliwe na TMZ w porównaniu z komórkami U138 – odpowiednio 10,6% vs 5,92% komórek w późnej apoptozie/nekrozie. Dodanie CHQ znacząco zwiększyło odsetek indukowanych przez TMZ komórek PI-dodatnich w późnej apoptozie/nekrozie w hodowlach U138 (9,76%), ale nie w U87 (10,63%). Jednocześnie łączone leczenie TMZ + CHQ znacząco zmniejszyło odsetek żywych komórek U138 (87,25%) w porównaniu z leczeniem samym TMZ (91,56%), czego nie zaobserwowano w hodowlach U87 (odpowiednio 87,42% vs 88,23%).

Próbki białkowe dużych EVs (LEVs) i małych EVs (SEVs) z kontroli traktowanych DMSO oraz komórek traktowanych 400 μM TMZ i 10 μM CHQ osobno i w kombinacji porównano za pomocą Western blot. Markery autofagii (LC3B-II i p62) oraz markery egzosomów (alix i syntenina-1) były synergistycznie regulowane w górę przez kombinację TMZ + CHQ odpowiednio w LEVs i SEVs. CD63, inny powszechnie stosowany marker EVs, był wykrywalny we wszystkich próbkach, w tym w kontrolach traktowanych DMSO, jednak również wykazywał znaczącą regulację w górę zarówno w LEVs, jak i SEVs po leczeniu TMZ + CHQ. Ponieważ CD63 jest silnie glikozylowany i zwykle tworzy smugi na Western blot, dla zwiększenia dokładności, ilościowo określono go za pomocą dot blot.

Podobnie jak CD63, kaweolina-1 była wykrywalna we wszystkich próbkach LEV, w tym w kontrolach. Jednak w przeciwieństwie do CD63, nie była obecna w SEVs z próbek kontrolnych, a podobnie jak markery egzosomów, była synergistycznie regulowana w górę przez TMZ i CHQ w SEVs. Marker mitochondrialny – cytochrom C1 (CYC1), który nie powinien być obecny w odpowiednio oczyszczonych EVs, nie został wykryty w żadnej z próbek, co wskazuje na odpowiednią czystość EVs uzyskanych w obecnym badaniu.

Zakres hydrodynamiczny EVs określono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLC). Tylko próbki z komórek traktowanych zarówno TMZ, jak i CHQ dawały wiarygodne pomiary, prawdopodobnie ze względu na bardzo małą liczbę EVs w innych próbkach. Rozmiar EVs TMZ + CHQ wynosił od 50 do 150 nm dla SEVs i 150-500 nm dla LEVs, co jest typowe odpowiednio dla egzosomów i mikropęcherzyków.

W lizatach całych komórek (WCL) sam TMZ nie indukował znaczącej akumulacji p62 lub lipidowanego, związanego z błoną LC3B-II; jednak te markery autofagii były znacząco regulowane w górę w próbkach TMZ + CHQ w porównaniu z pojedynczymi traktowaniami i kontrolami. Komórki U138-MG traktowane TMZ i CHQ reagowały podobnie do komórek U87 – przez silną synergistyczną regulację w górę LC3B-II i p62 w LEVs oraz kaweoliny w SEVs. W porównaniu z LEVs, poziomy p62 były znacznie niższe w SEVs, ale również były synergistycznie regulowane w górę w tych ostatnich. Chociaż, jak wspomniano powyżej, w hodowlach U138 leczenie TMZ + CHQ miało znacznie wyższy efekt cytotoksyczny w porównaniu z samym TMZ, CYC-1 nie był wykrywalny w żadnej z próbek EV. Wskazuje to, że obserwowany efekt wynika z aktywnych mechanizmów wydzielniczych, a nie z pasywnego uwalniania materiału z umierających komórek.

Implikacje terapeutyczne:

Różna odpowiedź komórek GBM i monocytów na leczenie wskazuje na specyficzność komórkową efektów
EVs mogą przyczyniać się do oporności na chemioterapię poprzez zwiększanie wypływu leków
Wzbogacenie kaweoliny-1 w EVs może modulować agresywność GBM i odpowiedź na terapię
Zrozumienie mechanizmów synergii TMZ+CHQ może prowadzić do optymalizacji strategii terapeutycznych

Czy wyniki wskazują na nowe mechanizmy oporności?

Czy wyniki te mogą wskazywać na nowe mechanizmy oporności na leczenie? Wewnątrz komórek kaweolina-1 jest głównie związana z kaweolami – inwaginacjami błony, których rozmiar jest podobny do egzosomów (50-100 nm). Chociaż wiadomo, że to białko jest wydzielane przez komórki nowotworowe w dużych onkosomach pochodzących z błony plazmatycznej o wartości prognostycznej dla przerzutowego raka, kaweole nie są znane z bezpośredniego uwalniania z błony plazmatycznej. Badanie wykazało, że leczenie CHQ skutecznie prowadzi do akumulacji dużych agregatów LC3B w CD63-dodatnich wakuolach wewnątrzkomórkowych, wskazując, że są to autolizosomy i/lub amfisomy. Inhibitor lizosomów indukował również kolokalizację między LC3B a kaweoliną-1 w tych stosunkowo dużych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, które mogą stanowić źródło indukowanych przez TMZ + CHQ EVs, w tym SEVs zawierających kaweolinę-1.

Czy uszkodzenia DNA napędzają wydzielanie EV?

Aby dowiedzieć się, czy CHQ może działać synergistycznie z innymi czynnikami genotoksycznymi w regulacji w górę wydzielania EV przez komórki glejaka, przeprowadzono eksperymenty z etopozydem – lekiem chemioterapeutycznym, który indukuje uszkodzenia DNA poprzez inhibicję topoizomerazy II. Wykorzystano 20 μM etopozydu po starannym miareczkowaniu jego stężenia, aby osiągnąć poziomy DDR (poprzez pomiar γH2A.X) porównywalne z tymi indukowanymi przez 400 μM TMZ. Wyniki wykazały, że podobnie jak TMZ, etopozyd znacząco zwiększa indukowane przez CHQ wydzielanie markerów autofagii przez komórki U87.

CHQ jest znany z indukowania uszkodzeń DNA i zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G0/1 w niektórych liniach komórkowych. W obecnym badaniu nie zaobserwowano żadnej znaczącej regulacji w górę γH2AX przez sam CHQ w komórkach U87, prawdopodobnie ze względu na jego stosunkowo niskie stężenie. W rzeczywistości sam CHQ prowadził do nieznacznej, ale konsekwentnej, chociaż nieistotnej statystycznie, regulacji w dół γH2AX, co kontrastowało z synergistyczną regulacją w górę po leczeniu TMZ + CHQ obserwowaną zarówno w Western blot, jak i immunocytochemii.

Bezpośredni wpływ CHQ i TMZ na integralność DNA zbadano za pomocą testu kometowego w warunkach alkalicznych, który wykrywa zarówno pojedyncze, jak i podwójne pęknięcia DNA. Wyniki pokazują, że leczenie TMZ indukuje uszkodzenia DNA, na co wskazuje znacznie zwiększona ilość DNA w ogonach komet. CHQ, sam lub w połączeniu z TMZ, nie zwiększał zakresu uszkodzeń DNA ani nie wpływał znacząco na indukowane przez TMZ zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G2/M.

Stężenie pozakomórkowego DNA mierzono bezpośrednio w kondycjonowanych supernatantach komórek hodowanych w FluoroBrite™ DMEM za pomocą zestawu Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (HS). W porównaniu z kontrolami DMSO lub pojedynczymi traktowaniami, zaobserwowano znaczącą regulację w górę pozakomórkowego dsDNA w próbkach traktowanych TMZ + CHQ. “Nasze obserwacje wskazują na aktywację niekonwencjonalnych szlaków sekrecyjnych jako mechanizm obronny komórek nowotworowych w odpowiedzi na kombinowane leczenie” – podkreślają badacze.

Jak wcześniej donoszono, aktywne wydzielanie pozakomórkowego DNA może być albo zależne od EV, albo zależne od amfisomu/niezależne od egzosomu. Aby zbadać związek indukowanych przez TMZ + CHQ pozakomórkowych NA z EVs i cząsteczkami (EVPs), przeanalizowano próbki EV barwione PI za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ cytometria przepływowa małych EVs, takich jak egzosomy, jest utrudniona przez szum tła i efekty rojenia, w analizie uwzględniono tylko próbki dużych EVs. Jodek propidyny (100 ng/ml) dodano do próbek LEV zawieszonych w PBS, a PI+ EVPs określono ilościowo, stosując niską prędkość przepływu i ustalony czas (50 s). Wyniki pokazują, że sam TMZ powoduje znaczny wzrost liczby PI + EVPs, który jest dalej znacząco zwiększany przez dodanie CHQ. Traktowanie EVPs 1% Tritonem X100 obniżało liczbę PI+ EVPs we wszystkich traktowaniach o około 50%, wskazując, że próbki zawierają zarówno EVs, jak i cząsteczki odporne na Triton związane z NA.

Czy odpowiedź komórkowa różni się u monocytów i glejaków?

Następnie badacze chcieli się dowiedzieć, czy synergistyczna indukcja EVs przez CHQ i TMZ może być obserwowana w innych typach komórek. Monocyty są liczne w guzach GBM, stanowiąc do 30-50% komórek guza, i są nadwrażliwe na cytotoksyczny efekt TMZ, co ma implikacje dla terapii GBM. W badaniu wykorzystano hodowle monocytów THP-1 do zbadania ich odpowiedzi na TMZ i CHQ. W warunkach identycznych do tych stosowanych w przypadku komórek GBM, nie wykryto żadnej regulacji w górę LC3B-II, p62 lub markera egzosomalnego synteniny-1 w próbkach EV z komórek THP-1 traktowanych TMZ i CHQ.

W związku z tym w tych eksperymentach uwzględniono bafilomycynę A1 (BafA1), która podobnie jak CHQ jest często stosowana do hamowania funkcji lizosomów, a w konsekwencji degradacyjnej autofagii. Leczenie komórek THP-1 50 nM BafA1 samo indukowało wydzielanie badanych markerów, co zostało dodatkowo znacząco zwiększone przez TMZ. Analiza DLS potwierdziła, że leczenie TMZ + BafA1 indukowało wydzielanie pęcherzyków o typowych profilach rozkładu wielkości dla egzosomów i LEVs, z modami odpowiednio 126 i 239 nm.

W WCL komórek THP-1 zarówno CHQ, jak i BafA1 indukowały akumulację LC3B-II; jednak tylko BafA1 regulował w górę p62. W przeciwieństwie do komórek GBM, TMZ, czy to sam, czy w połączeniu z inhibitorami lizosomalnymi, nie wpływał na poziomy LC3B-II i p62 w monocytach. Wyniki testu żywotności komórek potwierdziły, że w porównaniu z komórkami GBM, monocyty THP-1 były bardziej wrażliwe na leczenie TMZ, z ~40% komórek PI-dodatnich po 48-godzinnym leczeniu 400 μM TMZ. Podczas gdy leczenie CHQ nie wpływało na żywotność THP-1, ani samo, ani w połączeniu z TMZ, BafA1 był cytotoksyczny sam w sobie i znacząco bardziej w połączeniu z TMZ.

Eksperymenty z wyższymi stężeniami CHQ w monocytach THP-1 i makrofagach THP1 indukowanych PMA wykazały, że 50 i 100 μM CHQ indukują uwalnianie LC3B-II, p62 i synteniny-1. Jednak próbki LEV zawierały dużą ilość CYC1 – wskaźnika zanieczyszczenia próbek EV resztkami komórkowymi, co odzwierciedla znaczącą aktywność cytotoksyczną wysokich dawek CHQ. W przeciwieństwie do BafA1, ani 10, ani 50 μM CHQ nie mogły hamować proteolizy endocytowanego substratu DQ-OVA – wskaźnika zachowanej aktywności lizosomalnej w komórkach THP-1.

Leczenie U87 50 nM BafA1 indukowało wydzielanie LEVs zawierających LC3B-II, p62, CD63 i kaweolinę-1, co zostało znacząco wzmocnione przez TMZ. Podobnie jak w THP-1, BafA1 miał znaczący efekt cytotoksyczny na komórki glejaka, a po dodaniu TMZ komórki PI-dodatnie przekraczały 50%. Brefeldin A (BFA) jest inhibitorem wewnątrzkomórkowego transportu pęcherzyków i wydzielania EV, modulatorem autofagii i induktorem apoptozy; jednak wykazując cytotoksyczność porównywalną z BafA1, Brefeldin A nie zwiększał wykrywalnie wydzielania EV w hodowlach komórek U87 lub U138.

Jakie implikacje mają wyniki dla terapii nowotworowej?

Ogólnie te dane wskazują, że synergistyczna regulacja w górę EV obserwowana w tym badaniu nie wynika jedynie ze zwiększonego wyrzucania ciałek apoptotycznych i resztek komórkowych, ale raczej zależy od aktywnych niekonwencjonalnych mechanizmów wydzielniczych.

To badanie podkreśla zdolność CHQ i TMZ do synergistycznego aktywowania autofagii wydzielniczej w komórkach GBM, co wykazano poprzez zwiększone uwalnianie EVs zawierających markery autofagii i pozakomórkowych kwasów nukleinowych. Efekt ten nie ogranicza się do CHQ i TMZ, jak pokazano przez traktowanie etopozydem i bafilomycyną A1, i prawdopodobnie jest napędzany przez uszkodzenie DNA w kontekście inhibicji lizosomów/późnej fazy autofagii. Tę synergię można wyjaśnić przez crosstalk między kaskadami sygnałowymi i mechanizmami mającymi na celu złagodzenie cytotoksycznych efektów inhibitorów autofagii i indukowanej przez TMZ akumulacji uszkodzonych cząsteczek DNA/RNA. Synergistyczne wzmocnienie wydzielania EV było również widoczne w monocytach i makrofagach THP-1 traktowanych TMZ i BafA1, sugerując szersze znaczenie w różnych typach komórek.

Ciekawą obserwacją w obecnym badaniu jest synergistyczna indukcja kaweoliny-1 przez TMZ i CHQ w małych EVs. W zaawansowanym stadium raka, w tym GBM, ekspresja kaweoliny-1 koreluje ze stopniem zaawansowania guza, a białko to przyczynia się do agresywności choroby, jak również jej oporności na terapię. Kaweolina-1 jest białkiem błony plazmatycznej i jest obecna w LEVs, w tym w onkosomach pochodzących z błony plazmatycznej. Jest również wzbogacona w egzosomach surowicy pacjentów z GBM w porównaniu ze zdrowymi kontrolami. Proponowany mechanizm implikuje autofagię wydzielniczą w biogenezie EVs zawierających kaweolinę-1, a dane przedstawione tutaj zgadzają się z tym modelem – jak wywnioskowano na podstawie zależnego od CHQ wydzielania SEVs załadowanych kaweoliną-1 i indukowanej przez CHQ akumulacji białka w dużych amfisomach/autolizosomach.

Oprócz działania jako inhibitor lizosomalny, CHQ ma aktywność interkalującą DNA, prowadzącą do zmiany struktury DNA i, w konsekwencji, aktywacji ATM pod nieobecność uszkodzenia DNA. Wykazano również, że w stężeniu użytym w obecnym badaniu (10 μM), CHQ zwiększa naprawę DNA, a nie uszkodzenia. Może to pomóc wyjaśnić pozorną rozbieżność zaobserwowaną tutaj – zwiększoną regulację w górę γH2Ax, gdy CHQ jest dodawany do leczenia TMZ, bez dalszej akumulacji pęknięć DNA lub zwiększonej liczby komórek zatrzymanych w fazie G2/M. Możliwe jest również, że niewielkie zwiększenie uszkodzonego DNA w komórkach traktowanych TMZ + CHQ może nie być wykrywalne za pomocą testu kometowego użytego w obecnym badaniu.

Jednak fragmentowane pozakomórkowe DNA, jak również cząsteczki RNA, były wykrywalne w kondycjonowanych supernatantach, a indukowane przez TMZ kwasy nukleinowe związane z EVP były dalej synergistycznie regulowane w górę przez dodanie CHQ. W tym względzie przedstawiona tutaj praca dołącza do rosnącej liczby badań, które wykazały związki między DDR a wydzielaniem EV. Mianowicie, uszkodzenie DNA może wpływać na wydzielanie i skład EVs i odwrotnie – EVs mogą wpływać na komórki poprzez regulację DDR. Uszkodzone jądrowe DNA jest aktywnie przenoszone do cytoplazmy, skąd może być wydalane z komórki poprzez zarówno zależne od autofagii, jak i niezależne niekonwencjonalne mechanizmy wydzielnicze. Ponadto EVs, w tym egzosomy, są znane jako nośniki do eksportu uszkodzonego DNA, jak również hybryd RNA-DNA. Akumulacja DNA i dwuniciowego RNA w cytoplazmie może aktywować cytotoksyczną, prozapalną sygnalizację, w dół od cGAS-STING i RIG-I/MDA, odpowiednio, prowadząc do starzenia się komórek. DDR indukowany przez TMZ został powiązany z aktywacją cytoprotekcyjnej autofagii. Oprócz łagodzenia szkodliwych skutków szlaków sygnałowych wywołanych przez cytoplazmatyczne DNA, autofagia wydzielnicza i EVs są znane z przyczyniania się do oporności komórkowej na leki genotoksyczne, w tym TMZ, poprzez zwiększanie wypływu tych ostatnich. W kontekście inhibicji lizosomalnej, przesunięcie w kierunku polegania na autofagii wydzielniczej w celu eliminacji uszkodzonych NA mogłoby wyjaśnić synergię zaobserwowaną w obecnym badaniu.

Jak inhibitorzy autofagii wpływają na cytotoksyczność komórek?

Chociaż nie możemy stwierdzić, czy synergistyczna odpowiedź EV na kombinowane leczenie TMZ i CHQ ogranicza się do komórek glejaka, przedstawione tutaj wyniki sugerują zależność od typu komórki. Efekt nie był obserwowany w monocytach i makrofagach THP-1 traktowanych tymi samymi stężeniami CHQ i TMZ co komórki GBM, mimo że leczenie TMZ było bardziej toksyczne dla THP-1 w porównaniu z komórkami GBM. CHQ regulował w górę LC3B-II w komórkach THP-1, jednak ekspresja p62 nie była dotknięta ani przez CHQ, ani TMZ. Sugeruje to, że w przeciwieństwie do komórek GBM, zależna od CHQ inhibicja aktywności lizosomalnej w komórkach THP-1 była stosunkowo nieefektywna. Wyższe stężenia CHQ indukowały wyładowanie EVs i markerów autofagii zarówno przez monocyty THP-1, jak i makrofagi różnicowane PMA; jednak korelowało to z cytotoksycznością leczenia i skutkowało zanieczyszczeniem próbek LEV przez CYC1. W tym względzie zaobserwowano, że CHQ hamuje autofagię poprzez upośledzenie fuzji autofagosomu z lizosomami, a nie poprzez wpływ na aktywność degradacyjną tego organellum. W przeciwieństwie do CHQ, BafA1 regulował w górę LC3B-II i p62, jak również uwalnianie EV zarówno w THP-1, jak i komórkach GBM, a TMZ dalej regulował w górę wydzielanie EV indukowane przez BafA1. Również w przeciwieństwie do CHQ, BafA1 hamował lizosomalną proteolizę substratu DQ-OVA przez monocyty THP-1. Podkreśla to mechanistyczne różnice między BafA1 a CHQ w inhibicji lizosomalnej i może tłumaczyć zmienność w indukcji EV obserwowaną w hodowlach THP-1, traktowanych dwoma inhibitorami.

Zarówno w THP-1, jak i komórkach glejaka, BafA1 wykazywał znaczącą cytotoksyczność sam w sobie, a jeszcze bardziej w połączeniu z TMZ, co mogło przyczynić się do silnego uwalniania EVP. Niemniej jednak nie wydaje się to być jedynym powodem synergii, ponieważ w hodowlach THP-1, TMZ miał znacznie wyższą cytotoksyczność w porównaniu z BafA1, bez indukowania jakiegokolwiek wykrywalnego uwalniania EV.

Czy perspektywy terapeutyczne zmieniają oblicze walki z GBM?

In vivo zarówno EVs, jak i bezkomórkowe NA są znane z promowania zdolności migracyjnej i przerzutowej komórek nowotworowych. Znaczące wzbogacenie kaweoliny-1 związanej z EV, która jest związana z agresywnością nowotworów i opornością na terapię, dodatkowo podkreśla potencjalną rolę tych EVs w modulowaniu agresywności GBM. Dlatego dalsze badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw synergistycznego działania opisanego tutaj mogą zapewnić jaśniejsze zrozumienie ogólnych efektów farmakologicznych podobnych kombinacji leków w GBM i innych typach komórek nowotworowych.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na roli pęcherzyków pozakomórkowych (EVs) w rozwoju i agresywności glejaka wielopostaciowego (GBM). Wykazano, że kombinacja temozolomidu (TMZ) z chlorochiną (CHQ) prowadzi do synergistycznej aktywacji autofagii wydzielniczej w komórkach GBM, co skutkuje zwiększonym uwalnianiem EVs zawierających markery autofagii i pozakomórkowe kwasy nukleinowe. Ten efekt nie ogranicza się tylko do kombinacji TMZ i CHQ, ale występuje również przy zastosowaniu innych czynników genotoksycznych, jak etopozyd czy bafilomycyna A1. Istotnym odkryciem jest synergistyczna indukcja kaweoliny-1 w małych EVs przez TMZ i CHQ, co może mieć związek z agresywnością nowotworu i opornością na terapię. Badania wykazały również różnice w odpowiedzi na leczenie między komórkami GBM a monocytami, podkreślając specyficzność komórkową obserwowanych efektów. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tej synergii może przyczynić się do lepszego poznania działania kombinacji leków w terapii GBM.