Autophagia w terapii nowotworów – nowe możliwości leczenia

Czym jest autophagia i dlaczego warto o niej pamiętać?

Autophagia, czyli proces „samotrawienny” komórki, stanowi kluczowy mechanizm, poprzez który organelle cytoplazmatyczne i białka są sekwestrowane w pęcherzykach autofagicznych i dostarczane do lizosomów w celu degradacji i recyklingu. Ten proces pełni funkcję porządkującą, regulując obrót organelli i białek komórkowych. Badania wykazały, że autophagia ulega deregulacji w określonych stanach patologicznych, w tym w nowotworach. W normalnych warunkach autophagia prawdopodobnie hamuje transformację komórkową i progresję guza poprzez ograniczanie niestabilności chromosomowej. Z drugiej strony, udowodniono, że rozwinięte nowotwory wykorzystują autofagię do przetrwania okresów stresu metabolicznego lub hipoksycznego. Manipulacja autofagią stała się więc potencjalnym obszarem rozwoju nowych strategii przeciwnowotworowych.

Aminochinoliny, takie jak chlorochina (CQ), hamują autofagię poprzez mechanizmy odmienne od innych inhibitorów, jak 3-metyloadenina (3-MA). Podczas gdy 3-MA hamuje wczesną fazę autofagii, hamując tworzenie kwaśnych organelli pęcherzykowych (AVO), CQ hamuje autofagię w jej późnych fazach, po utworzeniu cytoplazmatycznych AVO. W rezultacie komórki traktowane CQ wykazują akumulację cytoplazmatycznych AVO. CQ zidentyfikowano jako środek uwrażliwiający na chemioterapię, gdy stosuje się go w połączeniu z określonymi lekami przeciwnowotworowymi. Właściwości lizosomotropowe CQ są prawdopodobnie odpowiedzialne za wiele jej efektów biologicznych. Rosnące dowody sugerują, że poprzez swój efekt lizosomotropowy, CQ może uwrażliwiać komórki nowotworowe na działanie zabójcze różnych środków chemioterapeutycznych i promieniowania jonizującego.

Czy blokowanie autofagii poprawia skuteczność terapii przeciwnowotworowej?

W małym randomizowanym badaniu Sotelo i współpracownicy wykazali poprawę przeżywalności u pacjentów z glejakiem wielopostaciowym leczonych 4 cyklami karmustyny z radioterapią i CQ w porównaniu z placebo, rozpoczynając 5 dni po operacji. Amaravadi i współpracownicy wykazali, że celowanie w autofagię pochodnymi CQ zwiększało skuteczność chemioterapii. Hydroksychlorochina (HCQ) została szeroko przebadana w połączeniu z kilkoma środkami przeciwnowotworowymi w celu oceny jej bezpieczeństwa klinicznego i aktywności. W szeregu badań fazy I maksymalna tolerowana dawka (MTD) HCQ wynosiła od 200 do 1200 mg dziennie.

HCQ była badana w połączeniu z temozolomidem 150 mg u pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi. Wolpin i współpracownicy przedstawili bezpieczeństwo i aktywność przeciwnowotworową HCQ u 20 pacjentów z przerzutowym rakiem trzustki, którzy nie odpowiedzieli na konwencjonalną chemioterapię. W tym badaniu fazy II pacjenci otrzymywali 400 (n = 10) lub 600 (n = 10) mg HCQ dwa razy dziennie jako pojedynczy środek. Chociaż te dawki były ogólnie dobrze tolerowane, u dwóch pacjentów wystąpiły poważne zdarzenia niepożądane związane z leczeniem. Pięć innych badań fazy I HCQ obejmowało połączenie z różnymi środkami chemioterapeutycznymi, w tym temozolomidem, bortezomibem, temsirolimusem, worinostatem lub doksorubicyną. U szeregu pacjentów z czerniakiem, rakiem jelita grubego, szpiczakiem i rakiem nerkowokomórkowym wykazano częściowe odpowiedzi lub stabilną chorobę, co sugeruje aktywność przeciwnowotworową.

W badaniu fazy II u pacjentów z zaawansowanym rakiem trzustki, Karasic i współpracownicy wykazali, że HCQ w dawce 600 mg dziennie w połączeniu z gemcytabiną i nab-paklitakselem skutkowało poprawą wskaźnika odpowiedzi, co czyniło niektóre guzy resekcyjnymi. W oparciu o te przesłanki oraz znaczenie gemcytabiny i karboplatyny w leczeniu wielu typów nowotworów, nasze badanie zostało zaprojektowane, aby sprawdzić, czy CQ ponownie uwrażliwi na stosowanie chemioterapii u intensywnie leczonych pacjentów. “Pacjenci włączeni do naszego badania fazy I byli w większości intensywnie leczeni i byli kandydatami do systemowej terapii karboplatyną i gemcytabiną, stąd wybór rozpoczęcia od niższych dawek HCQ” – wyjaśniają autorzy badania.

Głównym celem badania było określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD) chlorochiny (CQ) lub hydroksychlorochiny (HCQ) w połączeniu z karboplatyną i gemcytabiną (CG) u pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi. Cele drugorzędowe obejmowały oszacowanie ogólnego wskaźnika odpowiedzi (ORR), przeżycia wolnego od progresji (PFS) i całkowitego przeżycia (OS) u pacjentów, określenie farmakokinetyki CQ/HCQ w połączeniu z CG oraz wykrycie wpływu na autofagię poprzez poziomy egzosomalnego białka związanego z mikrotubulami 1A/1B łańcucha lekkiego 3B (LC3) we krwi obwodowej.

Badanie zostało zaprojektowane jako jednoośrodkowe badanie fazy I z eskalacją dawki według schematu 3+3. Kwalifikowali się do niego pacjenci z zaawansowanymi guzami litymi, dla których nie było dostępnego innego standardowego leczenia lub dla których karboplatyna i gemcytabina były uważane za akceptowalną opcję leczenia, oraz ze statusem wydolności ECOG 0-1. Leczono sekwencyjne kohorty 3-6 pacjentów z dawką CQ/HCQ. Dawka początkowa CQ wynosiła 50 mg dziennie w połączeniu z karboplatyną i gemcytabiną. Pacjenci w kohorcie 1 byli leczeni CQ; jednak CQ stała się niedostępna z powodu ogólnokrajowego niedoboru, więc badanie kontynuowano z użyciem HCQ w kohortach 2, 3 i kohorcie rozszerzonej za zgodą IRB.

Kwalifikujący się pacjenci zostali włączeni do tego zatwierdzonego przez IRB badania za pośrednictwem Biura Badań Klinicznych (CTO) Instytutu Raka Uniwersytetu w Cincinnati. Aby zarejestrować pacjenta, uzyskano wszystkie następujące dokumenty: pisemny formularz świadomej zgody, formularz autoryzacji ustawy o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych (HIPAA), arkusz przesiewowy kwalifikowalności i formularz rejestracyjny. Badanie zostało wymienione na stronie https://clinicaltrials.gov (NCT02071537).

Kryteria kwalifikacji wymagały: histologicznie lub cytologicznie potwierdzonego przerzutowego lub nieresekcyjnego nowotworu, dla którego standardowe środki lecznicze nie istnieją, nie są już skuteczne lub dla którego kombinacja karboplatyny i gemcytabiny jest uważana za rozsądną opcję leczenia; braku innego aktywnego nowotworu złośliwego lub przewlekłej ogólnoustrojowej immunoterapii, oraz braku znanego niedoboru G6PD; wieku ≥18 lat; statusu wydolności ECOG <2 (Karnofsky >60%), akceptowalnej funkcji narządów i szpiku kostnego zdefiniowanej jako bezwzględna liczba neutrofili ≥1,500/µL, liczba płytek krwi ≥100,000/µL, całkowita bilirubina <1.5X górnej granicy normy (ULN), AST (SGOT) lub ALT(SGPT) <3X ULN, odpowiednia wyjściowa funkcja nerek z kreatyniną w surowicy <1.5X ULN, oczekiwana długość życia >3 miesięcy oraz co najmniej jedna mierzalna zmiana według RECIST 1.1. Pacjenci z leczonymi i bezobjawowymi przerzutami do mózgu kwalifikowali się. Kobiety i mężczyźni w wieku rozrodczym musieli zgodzić się na stosowanie odpowiedniej antykoncepcji przez czas trwania badania, a uczestnicy musieli mieć zdolność do zrozumienia i chęć podpisania pisemnego dokumentu świadomej zgody. Pacjenci otrzymujący inne środki badawcze, osoby z nieleczonymi przerzutami do mózgu, historią reakcji alergicznych na CQ/HCQ lub inne środki stosowane w badaniu oraz niekontrolowaną chorobą współistniejącą lub infekcją nie kwalifikowali się.

CQ lub HCQ podawano w dawkach wskazanych w tabeli 1 przez łącznie cztery 21-dniowe cykle leczenia (początkowo stosowano HCQ, następnie z powodu niedostępności HCQ pacjenci przeszli na CQ). CQ podawano doustnie codziennie, począwszy od tygodnia przed rozpoczęciem chemioterapii karboplatyną i gemcytabiną (CG) (dzień -7 do dnia 1), a następnie przez cały 21-dniowy cykl, przez łącznie 4 cykle leczenia CG. Dodatkowe 5. i 6. cykle karboplatyny i gemcytabiny były dozwolone bez dodawania CQ lub HCQ w przypadku kontynuowanej odpowiedzi lub korzyści według decyzji badacza prowadzącego leczenie. Niższa i wyższa grupa dawkowa (N = 6 i 3, odpowiednio) otrzymywała 50 mg lub 150 mg CQ lub HCQ jako stałą dawkę doustną dziennie. Pierwszych siedmiu pacjentów otrzymało CQ 50 mg; 50 mg podano w formie zawiesiny, a następnie 100 mg podano przez podzielenie tabletki 200 mg (gdzie pierwszy pacjent otrzymał tylko jedną dawkę 50 mg CQ i został uznany za niekwalifikującego się w dniu 1 i został wykluczony i zastąpiony), a następni 3 pacjenci otrzymali 100 mg HCQ z powodu światowego niedoboru i niedostępności CQ. Trzecia kohorta otrzymała 150 mg HCQ, a kohorta rozszerzona 10 pacjentów otrzymała 100 mg HCQ. Tabletki HCQ były dzielone na pół, aby zapewnić dawkę 100 mg. Zostało to wykonane przez doświadczonego farmaceutę klinicznego, aby zapewnić, że wszyscy pacjenci otrzymują taką samą dawkę.

Czy takie dawki okażą się skuteczne w poprawie odpowiedzi na chemioterapię u pacjentów z zaawansowanymi nowotworami? Jak wpłynie to na profil bezpieczeństwa leczenia? Te pytania stanowiły kluczowy element badania.

Dawka limitująca toksyczność (DLT) HCQ wynosiła 150 mg w połączeniu z karboplatyną i gemcytabiną. Główna toksyczność występowała jednak z powodu cytotoksycznej chemioterapii u intensywnie leczonych wcześniej pacjentów. Maksymalna tolerowana dawka (MTD) HCQ wynosiła 100 mg w połączeniu z karboplatyną i gemcytabiną.

Ocena bezpieczeństwa i wyników opierała się na zrewidowanych kryteriach terminologicznych dla zdarzeń niepożądanych Narodowego Instytutu Raka (NCI) (CTCAE) wersja 4.0. Pierwszorzędowe punkty końcowe obejmowały zdarzenia niepożądane stopnia >3 według CTCAE wyraźnie związane z leczeniem i nie samoograniczające się lub nie ustępujące w ciągu mniej niż 7 dni. Drugorzędowe punkty końcowe obejmowały kryteria odpowiedzi RECIST 1.1: całkowitą odpowiedź (CR), częściową odpowiedź (PR), stabilną chorobę (SD) i progresję choroby (PD). Czas trwania ogólnej odpowiedzi był mierzony od momentu spełnienia kryteriów pomiaru dla CR lub PR (w zależności od tego, co zostało najpierw zarejestrowane) do pierwszej daty, w której nawrót lub postępująca choroba jest obiektywnie udokumentowana. Czas trwania stabilnej choroby jest mierzony od początku leczenia do momentu spełnienia kryteriów progresji, biorąc jako odniesienie najmniejsze pomiary zarejestrowane od momentu rozpoczęcia leczenia. Przeżycie wolne od progresji (PFS) jest definiowane jako czas od rozpoczęcia leczenia do momentu progresji.

Ze względu na potencjalną toksyczność oczną CQ/HCQ, wszyscy uczestnicy przeszli podstawowe badanie oczne/dna oka przed rozpoczęciem leczenia CQ/HCQ i powtórne badanie na końcu badania, aby upewnić się, że nie ma toksyczności ocznej.

Głównym punktem końcowym była toksyczność ograniczająca dawkę (DLT), a były one definiowane jako zmienne dychotomiczne w badaniu. Na każdym poziomie dawki DLT podsumowano za pomocą częstości (%). Drugorzędne punkty końcowe to zmienna dychotomiczna odpowiedzi na leczenie (CR lub PR), zdarzenia przeżycia wolnego od progresji (PF) i całkowitego przeżycia (OS) są oba cenzurowane po 12 miesiącach po leczeniu. Zmienne dychotomiczne odpowiedzi zostały podsumowane w częstości przy każdej wizycie kontrolnej. Krzywe Kaplana-Meiera zostały użyte do podsumowania PFS i OS w czasie. Dodatkowo, jako analizy eksploracyjne, modele logistyczne i proporcjonalnego hazardu Coxa zostały użyte do oceny związków zmiennych drugorzędowych z charakterystyką wyjściową, taką jak demografia pacjenta, typy i stadia nowotworów oraz plany terapii.

Określenie MTD nastąpiło przy użyciu algorytmu maksymalnie 6 pacjentów w każdej kohorcie. Nie była potrzebna analiza mocy, ponieważ podano tylko statystyki opisowe dla zmiennych pierwszorzędowych. Analizy zmiennych drugorzędowych opierały się na łącznej liczbie 10 pacjentów w kohorcie MDT. Stopniowa rekrutacja dla każdej kohorty, ponieważ każda kohorta była włączana zgodnie ze standardem 3-6 pacjentów i trwa do 28 dni, aby upewnić się, że nie ma poważnych zdarzeń niepożądanych przed przejściem do następnej kohorty.

Przegląd danych i wyników pacjentów był omawiany w momencie rozpoczęcia badania, przed rozszerzeniem lub przejściem do następnej kohorty oraz na końcu badania.

W badaniu wzięło udział dwudziestu trzech pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi, zarejestrowanych w latach 2014-2018. Wśród 22 kwalifikujących się leczonych pacjentów było 15 mężczyzn (68%) i 7 kobiet (32%) z medianą wieku 58 lat. Było 15 białych (68%), 6 Afroamerykanów (27%) i 1 pacjent azjatycki (5%). Jeśli chodzi o status wydolności ECOG (PS), 5 pacjentów miało PS 0 (22%), 14 miało PS 1 (64%), a 3 miało PS 2 (14%). Włączono różne typy histologiczne: 5 pacjentów miało gruczolakoraka (23%), 4 miało raka płaskonabłonkowego (18%), podczas gdy 13 miało różne typy (59%), w tym drobnokomórkowy, urotelialny, wątrobowokomórkowy i cholangiocarcinoma. Liczba schematów otrzymanych przed włączeniem do tego badania wynosiła 0 dla 3 pacjentów (14%), 1 dla 5 pacjentów (22%), 2 dla 3 pacjentów (14%) i 3 lub więcej schematów dla 11 pacjentów (50%).

Pierwsza kohorta składała się z 7 pacjentów, ponieważ pierwszy pacjent został wykluczony w dniu 1, ponieważ nie spełniał kryteriów kwalifikacyjnych, mając wyjściową liczbę płytek krwi mniejszą niż 100 000/µL. Kohorta 1 została rozszerzona do 6 pacjentów z powodu neutropenii i trombocytopenii związanej z chemioterapią. Komisja Monitorowania Bezpieczeństwa Danych zaleciła zmniejszenie dawki gemcytabiny z 1250 mg/m² do 1000 mg/m². Kolejnych 3 pacjentów, którzy zostali włączeni, tolerowało karboplatynę AUC = 5 i gemcytabinę 1000 mg/m² w dniach 1 i 8, oprócz CQ 50 mg, bez DLT.

HCQ zastąpiła CQ z powodu międzynarodowego niedoboru CQ w tym czasie. Druga kohorta obejmowała 3 pacjentów, którzy byli leczeni HCQ 100 mg dziennie bez DLT. Pierwsze 2 kohorty tego badania nie wykazały więc DLT przy dawkach 50 mg i 100 mg CQ i HCQ odpowiednio. Trzecia kohorta pacjentów obejmowała 3 pacjentów leczonych HCQ 150 mg dziennie, a 2 z nich doświadczyło DLT, głównie z powodu trombocytopenii stopnia 4 i neutropenii stopnia 3 trwającej ponad 7 dni. Pacjent z neutropenią nie otrzymał wsparcia czynnikami wzrostu. Nie było zgonów związanych z protokołem.

Jedna DLT wystąpiła u pacjentów leczonych HCQ 150 mg dziennie, a MTD dla tej kombinacji określono na 100 mg HCQ dziennie. Następnie 10 pacjentów zostało włączonych do kohorty rozszerzonej przy HCQ 100 mg z karboplatyną i gemcytabiną.

Oceniając wskaźnik odpowiedzi (RR) dla różnych pacjentów włączonych do tego badania, 1 pacjent osiągnął częściową odpowiedź (PR) (5%), 15 pacjentów miało stabilną chorobę (SD) (68%), podczas gdy 6 pacjentów miało progresję choroby (PD) (27%). Niemniej jednak wskaźnik kontroli choroby (DCR) wynosił 48% dla czasu trwania ponad 6 miesięcy, 21% dla ponad 12 miesięcy i 14% dla ponad 18 miesięcy. W analizie jednowymiarowej predyktorów śmiertelności z wszystkich przyczyn i predyktorów progresji choroby, ani wiek, płeć, liczba cykli nie były statystycznie istotne. Ogólnie wskaźnik odpowiedzi wynosił 71%. Przeżycie wolne od progresji (PFS) wynosiło 48% po 6 miesiącach. Wskaźnik kontroli choroby (DCR) wynosił 68% po 6 miesiącach, a mediana całkowitego przeżycia (OS) wynosiła 30% po 1 roku.

Co ciekawe, zaobserwowano, że pacjenci otrzymujący późniejszą immunoterapię po progresji w tym badaniu klinicznym mieli doskonałe wyniki kliniczne. “Jeden pacjent z rakiem płaskonabłonkowym płuc (kohorta 1) miał przedłużoną stabilną chorobę przez 11 miesięcy na CA + HCQ” – raportują badacze. Podobnie, przedłużona stabilna choroba została odnotowana u pacjenta z drobnokomórkowym rakiem płuc w kohorcie 3, który doświadczył progresji choroby w tym protokole, a następnie skorzystał z późniejszej terapii niwolumabem z częściową remisją i poprawą statusu wydolności z ECOG 2 do 0. Ten pacjent miał trwającą odpowiedź po 15 cyklach inhibitora PD-1. Inny starszy pacjent w kohorcie 3 z postępującym rakiem urotelialnym dobrze tolerował leczenie protokołem bez poważnych zdarzeń niepożądanych. Ten pacjent osiągnął kontrolę choroby przy późniejszej terapii atezolizumabem.

Jakie dane kliniczne i wyniki uzyskano w badaniu?

Aby ocenić wpływ leczenia na szlak autofagii, opracowano panel odpowiednich testów. Badanie obejmowało 24 pacjentów, którzy zostali zrekrutowani w 4 kohortach: kohorta 1 (n=6), kohorta 2 (n=3), kohorta 3 (n=3) i kohorta rozszerzona (n=8). U wszystkich pacjentów histologicznie zdiagnozowano zaawansowane guzy lite. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed leczeniem zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szpitala Uniwersyteckiego w Cincinnati. Zrekrutowani uczestnicy nie odpowiedzieli na poprzednie linie leczenia, a proponowany schemat chemioterapii (Carb/Gem) był uważany za standard opieki.

Próbki krwi pacjentów były zbierane w wymienionych punktach czasowych i wirowane przy 1500 g przez 15 minut. Górna faza (osocze) była zbierana w nowych probówkach i przechowywana w temperaturze -80 stopni do czasu użycia. Ekstrakcja egzosomów była wykonywana przy użyciu odczynnika do ekstrakcji egzosomów (Total Exosomes Precipitation Reagent from plasma, Invitrogen by Thermo-Fisher Scientific Ref: 4484451) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie zawieszone w PBS i przechowywane w temperaturze -80°C.

Egzosomy były ekstrahowane ze świeżo zebranej pożywki hodowlanej komórek przy użyciu odczynnika do precypitacji egzosomów (50ml Total Exosome Isolation from cell culture media, InvitrogenTm by Life TechnologiesTM, ref# 4478359) zgodnie z instrukcjami producenta. Ekstrahowane egzosomy były zawieszone w PBS i przechowywane w temperaturze -80°C. Metoda ekstrakcji od pacjenta jest opisana w pełnych szczegółach w źródle.

Wykrywanie ekspresji LC3b w izolowanych egzosomach przeprowadzono za pomocą western blottingu zgodnie ze standardowymi protokołami. Do skanowania membran użyto detekcji LI-COR. Wykrywanie białka LC3B osiągnięto za pomocą króliczego przeciwciała monoklonalnego anty-LC3B (Cell Signaling Inc., katalog #2775, USA). CD9 użyto jako kontroli ładowania i wybarwiono za pomocą króliczego przeciwciała monoklonalnego (#3700) z Cell Signaling Technology Inc. Wszystkie western bloty przeprowadzono na 4-15% gradientowych żelach po oszacowaniu i ujednoliceniu zawartości białka w próbkach przez BCA.

Komórki HEK293 były hodowane w naczyniach hodowlanych 10 cm w pożywce DMEM z 10% FBS. Pożywka była zastępowana pożywką DMEM z dFBS po osiągnięciu 40% konfluencji i inkubowana przez 24 godziny. Leki jako pojedyncze środki, Gem o stężeniu 20uM (Gem20), CQ o stężeniach 10uM (CQ10) i 20uM (CQ20), oraz w kombinacjach: Gem+CQ10 i Gem+CQ20 były używane do leczenia hodowanych komórek HEK293 w świeżej pożywce DMEM z dFBS przez 16 godzin. Zarówno komórki, jak i pożywka były zbierane, wirowane, a następnie przemywane i ostatecznie barwione jodkiem propidyny (PI) i aneksyną V przed uruchomieniem próbek. Analiza cyklu komórkowego była wykonywana przy użyciu świeżych komórek na FACS Calibur (Becton Dickinson) po inkubacji z 25 μg/ml PI. Fazy cyklu komórkowego były analizowane za pomocą programu CellQuest-Pro (Becton Dickinson).

Konwersja LC-3B z LC-3B I do II była używana jako wskaźnik autofagii, ponieważ mierzy dynamikę procesu poprzez odzwierciedlenie obrotu fuzji autofagosomu z lizosomami. Jednak zwiększona ekspresja obu izoform jest używana do pomiaru aktywności zarówno induktorów, jak i inhibitorów autofagii. Chociaż metoda ta jest biologicznie wyjaśniona, nie było wyjaśnienia, jak rozróżnić oba działania, i jeśli nie zostaną użyte inne metody kwantyfikacji, oba działania mogą być interpretowane podobnie na western blottingu. “Nasze wyniki in vitro pokazały inny obraz dla każdego, gdy LC3-B był mierzony w egzosomach zamiast w komórkach” – zaznaczają badacze. Wniosek ten może służyć jako prosta i opłacalna metoda śledzenia wpływu bodźca na autofagię poprzez interpretację western blottingu w porównaniu z dobrze znanymi kontrolami.

Czy modyfikacja autofagii otwiera nowe perspektywy leczenia nowotworów?

CQ/HCQ jest w 60% związana z białkami osocza i usuwana równo przez nerki i wątrobę. Po podaniu CQ jest szybko dealkilowana przez cytochrom p450 (CYP) do aktywnej desetylchlorochiny i bisdesetylchlorochiny z okresem półtrwania eliminacji od 20 do 60 dni. Zarówno lek macierzysty, jak i metabolit można wykryć w moczu miesiące po pojedynczej dawce.

CQ/HCQ ma szybkie i prawie całkowite wchłanianie, a szczytowe stężenia w osoczu osiągane są w ciągu 1-2 godzin po podaniu doustnym. CQ/HCQ ma długi okres półtrwania wynoszący 3-5 dni. W celu analizy farmakokinetycznej pobrano próbki krwi (5 ml na punkt czasowy) w dniu -7 na początku przed dawką, a następnie po 1, 2, 4, 6 i 24 godzinach w dniu 1. Poziomy minimalne pobrano w dniach 8 i 15. Próbki krwi pobierano w każdym kolejnym cyklu (cykle 2-4) w dniu 1 po 1, 2, 4, 6, 24, 48 i 72 godzinach. Poziomy minimalne pobierano w dniach 8 i 15 dla cykli 2-4. Krew była zbierana do probówek B-D vacutainer zawierających K3-EDTA, mieszana i wirowana przy 1500 g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Osocze było przenoszone do probówki do przechowywania i utrzymywane na suchym lodzie do momentu przechowywania w zamrażarce -20°C. Poziomy minimalne po dawce dla CQ/HCQ były mierzone w dniach 8, 15 i 22.

Nasze badanie określiło MTD dla HCQ, która była bardzo bliska dawce określonej w badaniu używającym CQ w dodatku do standardowej terapii dla pacjentów z glejakiem wielopostaciowym. Nasze badanie używało CQ lub HCQ w połączeniu z karboplatyną i gemcytabiną (CG) w populacji pacjentów intensywnie leczonych z różnymi zaawansowanymi guzami litymi. W rezultacie MTD wydawała się być znacznie niższa niż dawka MTD CQ lub HCQ w innych raportowanych badaniach. Najwyższa kohorta dawkowa w obecnym badaniu obejmowała pacjentów, którzy byli intensywnie leczeni i doświadczyli >7 dni neutropenii lub trombocytopenii. Nie wystąpiły zgony w trakcie badania. Inne badania, które obejmowały CQ lub HCQ, były w stanie dostarczyć wyższe dawki tych środków, biorąc pod uwagę, że badania te obejmowały środki, które zwykle nie są mielosupresyjne, lub u osób nieleczonych chemioterapią.

Nasze obserwacje, że późniejsze odpowiedzi na środki immunoterapeutyczne, takie jak inhibitory PD-1 lub PD-L1, mogą być wzmocnione po inhibicji autofagii, są intrygujące. Czy połączenie środków modyfikujących autofagię z ewoluującą immunoterapią jako potencjalna nowa opcja leczenia może stać się interesującym obszarem dla dodatkowych badań, zarówno w laboratorium, jak i w klinice?

Autofagia jest zaangażowana w przetwarzanie antygenów nowotworowych i ich prezentację układowi odpornościowemu, a zatem może być uważana za linię obrony przed rakiem. Szlaki autofagiczne indukowane przez hipoksję w mikrośrodowisku guza mogą upośledzać przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne zapośredniczone przez limfocyty T cytotoksyczne (CTL) i komórki naturalnych zabójców (NK), a także wykazano, że zwiększają immunosupresyjne właściwości komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC).

W odpowiedzi na hipoksję, rodzina czynników transkrypcyjnych indukowanych hipoksją (HIF) nie ulega ubikwitynacji, unikając w ten sposób degradacji przez system ubikwityna-proteasom. W rezultacie akumulują się w cytoplazmie i są transportowane do jądra komórkowego, prowadząc do aktywacji około 300 genów zaangażowanych w wiele procesów biologicznych, w tym angiogenezę, zwiększone przeżycie komórek, przerzuty, indukcję fenotypu podobnego do komórek macierzystych i ucieczkę immunologiczną. Celowanie w HIF-2α zmniejsza PD-L1, podczas gdy nadekspresja HIF-2α zwiększała ekspresję zarówno mRNA, jak i białka PD-L1 w komórkach raka nerki.

W swoim badaniu Wolpin i współpracownicy użyli HCQ jako monoterapii z wcześniej leczonym przerzutowym rakiem trzustki i osiągnęli znacznie niższą medianę PFS i OS (odpowiednio 46,5 i 69,0 dni), używając wyższych dawek HCQ (400 mg i 600 mg dwa razy dziennie). Również Malhotra i współpracownicy użyli chemioterapii (karboplatyna, paklitaksel (i bewacyzumab, jeśli spełniał kryteria)) w połączeniu z HCQ (dawka dwa razy dziennie od 200 do 600 mg) u nowo zdiagnozowanych pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc (NSCLC), osiągając PFS wynoszący 3,7 miesiąca, demonstrując w ten sposób poprawioną odpowiedź przy dodaniu HCQ nawet w niższych dawkach do schematu chemioterapii CG.

Chociaż mierzyliśmy ekspresję PDL-1 tylko w próbkach krwi za pomocą RNA, ponieważ nie pobrano drugich biopsji, dodanie HCQ do chemioterapii zwiększyło ekspresję PLD-1, co jest zgodne z badaniem Patela i współpracowników, w którym pobrano biopsje w trakcie badania po 1. cyklu leczenia od tylko 2 pacjentów, co zostało również wykazane przez próbki krwi od innych pacjentów.

Wyniki z tego badania pokazują, że HCQ otwiera nową erę dla intensywnie leczonych pacjentów naiwnych na HCQ, aby otrzymywali HCQ w połączeniu z chemioterapią, poprawiając w ten sposób zarówno przeżycie wolne od progresji, jak i całkowite przeżycie. Ponadto, pacjenci oporni na anty PDL-1 mogą być ponownie leczeni inhibitorami PDL-1 po otrzymaniu HCQ +/- chemioterapii ze względu na zdolność HCQ do zwiększania ekspresji PDL-1. “To wciąż ambitne hipotezy, które wymagają dalszych badań, i dlatego musimy rozszerzyć nasze badanie do fazy II” – konkludują autorzy.

Podsumowanie

Autophagia jest fundamentalnym procesem komórkowym odpowiedzialnym za degradację i recykling organelli oraz białek. W kontekście nowotworów jej rola jest dwojaka – może hamować rozwój guza we wczesnych stadiach, ale także wspierać przetrwanie rozwiniętych nowotworów. Badania kliniczne wykazały, że modyfikacja autofagii poprzez zastosowanie chlorochiny (CQ) i hydroksychlorochiny (HCQ) w połączeniu ze standardową chemioterapią może zwiększać jej skuteczność. Określono maksymalną tolerowaną dawkę (MTD) HCQ na poziomie 100 mg dziennie w kombinacji z karboplatyną i gemcytabiną. Wyniki badań wskazują na 71% ogólny wskaźnik odpowiedzi oraz 48% przeżycia wolnego od progresji po 6 miesiącach. Szczególnie interesujące okazały się obserwacje dotyczące poprawy odpowiedzi na późniejszą immunoterapię u pacjentów, którzy wcześniej otrzymywali leczenie z wykorzystaniem CQ/HCQ. Badania potwierdziły również bezpieczeństwo stosowania tych leków w określonych dawkach, otwierając nowe perspektywy w terapii przeciwnowotworowej.