Chlorochina jako wzmacniacz działania 5-fluorouracylu w terapii nowotworowej

Czy chlorochina może wzmocnić działanie 5-FU?

Badanie eksperymentalne przeprowadzone na komórkach raka piersi myszy 4T1 oraz modelu mysim in vivo wykazało, że chlorochina (CQ) znacząco wzmacnia działanie przeciwnowotworowe 5-fluorouracylu (5-FU) poprzez hamowanie szlaku ATP-P2X4-mTOR.

Populacja badana obejmowała linię komórkową mysiego raka piersi 4T1 w badaniach in vitro oraz myszy BALB/c z przeszczepionymi komórkami 4T1 w badaniach in vivo. W modelu zwierzęcym zastosowano podział na pięć grup eksperymentalnych (n=6), otrzymujących różne kombinacje 5-FU (20 mg/kg), CQ (50 mg/kg) oraz N-acetylocysteinę (NAC, 0,5% w wodzie pitnej).

Badanie ujawniło, że CQ skutecznie uwrażliwia komórki nowotworowe na działanie 5-FU poprzez wzmocnienie stresu oksydacyjnego indukowanego przez 5-FU. Testy proliferacji EDU wykazały znaczący spadek aktywności proliferacyjnej komórek 4T1 po leczeniu 5-FU, przy czym CQ istotnie wzmacniało ten efekt inhibicyjny. Dodanie NAC osłabiało hamujące działanie 5-FU, niezależnie od obecności CQ, co potwierdza kluczową rolę reaktywnych form tlenu (ROS) w mechanizmie działania tej kombinacji leków.

Kluczowym odkryciem było wykazanie, że CQ hamuje szlak sygnałowy ATP-P2X4-mTOR, który normalnie przyczynia się do oporności komórek nowotworowych na chemioterapię. Komórki nowotworowe po ekspozycji na 5-FU uwalniają ATP do środowiska zewnątrzkomórkowego, co aktywuje receptor P2X4 znajdujący się w lizosomach, prowadząc do aktywacji szlaku mTOR i osłabienia skuteczności leczenia. Zastosowanie apyrazy do usunięcia zewnątrzkomórkowego ATP podczas leczenia 5-FU znacząco zwiększyło skuteczność terapeutyczną, co potwierdza rolę ATP w oporności na leczenie.

Jak potwierdzono mechanizm hamowania mTOR?

Analiza Western blot potwierdziła, że CQ znacząco hamuje fosforylację białka rybosomalnego S6 (downstream mTOR) w zakresie stężeń od 50 μM do 1 μM. Badania ekspresji genów wykazały, że P2X4 wykazuje najwyższą ekspresję wśród rodziny receptorów P2X w komórkach 4T1, a badania kolokalizacji potwierdziły, że P2X4 jest zlokalizowany głównie w lizosomach.

Interesującym odkryciem było zaobserwowanie, że CQ powoduje zakwaszenie lizosomów w komórkach nowotworowych, co stoi w sprzeczności z wcześniejszymi doniesieniami sugerującymi, że CQ alkalizuje środowisko lizosomalne. Pomiary pH lizosomalnego z wykorzystaniem sond lysosensor yellow/blue DND-160 (PDMPO) i lysosensor green DND-189 wykazały, że po zastosowaniu CQ pH wynosiło około 3,99, co było znacząco niższe niż w grupach kontrolnych. Ten efekt przypisuje się hiperaktywacji kompleksu V-ATPazy, co skutkuje zmniejszeniem aktywności receptora P2X4 w zakwaszonych lizosomach, blokując w ten sposób transdukcję sygnału ATP-mTOR.

Aktywacja P2X4 wyzwala uwalnianie Ca²⁺, dlatego zbadano uwalnianie Ca²⁺ indukowane aktywacją ATP P2X4 za pomocą Fluo-4 AM, aby pośrednio ocenić aktywność P2X4. Intensywność fluorescencji Fluo-4 AM w grupie leczonej CQ była najniższa, co wskazuje, że aktywność P2X4 była hamowana przez CQ. W przeciwieństwie do tego, leczenie komórek bafilomycyną A1, która zwiększa wartość pH lizosomalnego, spowodowało znaczący wzrost fosforylacji białka rybosomalnego S6.

Czy wyniki in vivo potwierdzają skuteczność terapii?

Badania in vivo potwierdziły, że kombinacja 5-FU i CQ wykazuje najsilniejsze działanie przeciwnowotworowe w porównaniu z monoterapią lub grupą kontrolną. Myszy leczone 5-FU + CQ miały najmniejsze guzy, co potwierdzono zarówno pomiarami objętości guza, jak i badaniami histologicznymi (barwienie H&E i Ki67). Co istotne, nie zaobserwowano znaczących różnic w masie ciała między grupami, co sugeruje niską toksyczność systemową zastosowanego leczenia.

Model mysi zastosowany w tym badaniu wykazał wysoką konserwację podstawowych mechanizmów regulacyjnych sygnalizacji mTOR z systemami ludzkimi. Krytyczne komponenty szlaku, w tym wzorce aktywacji mTOR zależne od insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 oraz funkcjonalna lokalizacja receptora P2X4 w lizosomach, wykazują konserwację międzygatunkową. Jednak profilowanie proteomiczne ujawniło specyficzne dla gatunku różnice metaboliczne – guzy mysie opierają się głównie na degradacji kwasów tłuszczowych i aktywacji szlaku FOXO dla homeostazy energetycznej, podczas gdy ludzkie komórki nowotworowe wykorzystują preferencyjnie metabolizm galaktozy w połączeniu z sygnalizacją JAK-STAT.

Jakie kliniczne implikacje niosą te odkrycia?

Wyniki te mają istotne znaczenie kliniczne, ponieważ wskazują na potencjał repozycjonowania CQ jako adiuwanta w chemioterapii, szczególnie w kombinacji z 5-FU. Mechanizm działania poprzez hamowanie szlaku ATP-P2X4-mTOR oferuje nowe podejście do przezwyciężania oporności na chemioterapię. Dodatkowo, odkryty mechanizm ma potencjalne powiązania z sygnalizacją AMPK, co otwiera możliwości dla strategii podwójnego celowania w szlaki AMPK i mTOR, potencjalnie pozwalając na zmniejszenie dawek inhibitorów mTOR i związanych z nimi toksyczności.

Badanie to dostarcza nowych molekularnych podstaw do klinicznego zastosowania CQ jako adiuwanta chemioterapeutycznego, oferując alternatywne podejście do blokowania szlaku mTOR w terapii przeciwnowotworowej.

Podsumowanie

Badania przeprowadzone na komórkach raka piersi myszy 4T1 oraz modelu mysim in vivo wykazały, że chlorochina skutecznie wzmacnia działanie przeciwnowotworowe 5-fluorouracylu poprzez hamowanie szlaku ATP-P2X4-mTOR. Mechanizm działania polega na wzmocnieniu stresu oksydacyjnego indukowanego przez 5-FU oraz hamowaniu szlaku sygnałowego, który odpowiada za oporność komórek nowotworowych na chemioterapię. Chlorochina powoduje zakwaszenie lizosomów w komórkach nowotworowych, co prowadzi do zmniejszenia aktywności receptora P2X4 i blokady transdukcji sygnału ATP-mTOR. Badania in vivo potwierdziły skuteczność terapii łączonej, wykazując najsilniejsze działanie przeciwnowotworowe przy jednoczesnym zachowaniu niskiej toksyczności systemowej. Odkrycia te mają istotne znaczenie kliniczne, wskazując na potencjał wykorzystania chlorochiny jako adiuwanta w chemioterapii.