Chlorochina wzmacnia chemioterapię nowotworów – przełom w onkologii?

Czy chlorochina może wzmocnić działanie leków platynowych?

Monoterapia lekami genotoksycznymi w onkologii wiąże się z poważnymi ograniczeniami – wysoką toksycznością, rozwojem oporności i nawrotami choroby. Szczególnie leki platynowe, mimo centralnej roli w leczeniu nowotworów piersi, jajnika czy jelita grubego, powodują ciężkie działania niepożądane: nefrotoksyczność (cisplatyna), mielosupresję z trombocytopenią (karboplatyna) oraz uporczywe nudności i wymioty. Redukcja dawki zmniejsza toksyczność, ale jednocześnie obniża skuteczność terapii, pozostawiając żywotne komórki nowotworowe zdolne do wznowy proliferacji.

Zespół międzynarodowy opublikował w International Journal of Molecular Sciences wyniki badań in vitro wskazujące na synergizm między chlorochiną (CQ) – znanym inhibitorem lizosomalnym – a lekami platynowymi oraz inhibitorami odpowiedzi na stres replikacyjny (RSR). Chlorochina, pierwotnie stosowana jako lek przeciwmalaryczny, od lat jest badana jako potencjalny adiuwant w terapii onkologicznej ze względu na niską cenę, doustną biodostępność i relatywnie dobrą tolerancję w zalecanych dawkach terapeutycznych.

Kluczowym odkryciem jest mechanizm działania CQ: lek nasila stres replikacyjny wywołany przez karboplatynę poprzez obniżenie dostępności nukleotydów niezbędnych do syntezy DNA. To prowadzi do zwiększonej fosforylacji kinazy Chk1 (Ser345) – uznanego markera stresu replikacyjnego – oraz zatrzymania cyklu komórkowego w fazie S/G1. Efektem końcowym jest masowa apoptoza komórek nowotworowych i całkowite zniesienie ich zdolności do formowania kolonii po zakończeniu leczenia.

Jak przeprowadzono badania nad synergią chlorochiny i leków platynowych?

Eksperymenty wykonano na trzech liniach komórkowych nowotworów: MCF7 i SKBR3 (rak piersi) oraz HCT116 (rak jelita grubego). Komórki traktowano karboplatyną (50-80 µM) w połączeniu z chlorochiną (15-40 µM) lub innymi inhibitorami lizosomalnymi (NH₄Cl). Badano również kombinacje z inhibitorami RSR: ceralasertibem (ATRi) i prexasertibem (Chk1i).

Główne metody obejmowały: test MTT oceniający żywotność komórek, test formowania kolonii (clonogenic assay) mierzący zdolność do długoterminowej proliferacji po leczeniu, cytometrię przepływową z barwieniem Annexin V/PI (apoptoza) oraz analizę faz cyklu komórkowego. Western blot służył do pomiaru poziomu fosforylowanej kinazy Chk1 (p-Chk1 Ser345) oraz markera autofagii LC3A/B. Punkty czasowe obserwacji: 24h, 48h, 72h oraz 10 dni dla testów kolonii.

Stężenia leków dobrano tak, aby w monoterapii część komórek zachowywała zdolność do ponownej proliferacji – pozwoliło to wyraźnie zademonstrować efekt synergiczny kombinacji. Dla MCF7 wybrano 50 µM karboplatyny i 15 µM CQ, dla SKBR3 – 50 µM karboplatyny i 40 µM CQ, dla HCT116 – 80 µM karboplatyny i 40 µM CQ.

Jak chlorochina hamuje zdolność komórek do ponownej proliferacji?

Test formowania kolonii wykazał dramatyczny efekt kombinacji CQ z lekami platynowymi. Komórki MCF7 traktowane samą karboplatyną (50 µM) tworzyły liczne kolonie po zakończeniu leczenia. Dodanie 15 µM chlorochiny niemal całkowicie zniosło tę zdolność. Podobny efekt zaobserwowano w linii SKBR3 (40 µM CQ + 50 µM karboplatyna) oraz HCT116 (40 µM CQ + 80 µM karboplatyna).

Analiza wzrostu komórek w czasie potwierdza te obserwacje: kombinacja CQ z karboplatyną skutkowała znacznie silniejszą inhibicją proliferacji w porównaniu do monoterapii każdym z leków. Co istotne, efekt nie był ograniczony do karboplatyny – cisplatyna w kombinacji z CQ również wykazywała synergizm w linii MCF7.

Barwienie Annexin V/PI ujawniło, że kombinacja leków zwiększała odsetek komórek apoptotycznych zarówno we wczesnej, jak i późnej fazie. W linii MCF7 maksymalny efekt obserwowano w 72h i 5 dni po leczeniu, w SKBR3 – już w 24h z kontynuacją w 72h. Monoterapia chlorochiną powodowała przejściowy wzrost apoptozy w pierwszych 24-72h, ale do 5. dnia odsetek apoptotycznych komórek stawał się porównywalny z kontrolą – co sugeruje, że część komórek była w stanie przetrwać i naprawić uszkodzenia.

„Nasze wyniki sugerują, że CQ odgrywa rolę przeciwnowotworową w kombinacji z lekami platynowymi poprzez zwiększenie ich cytotoksyczności i zniesienie potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych po leczeniu” – piszą autorzy badania.

Jaki mechanizm odpowiada za wzmocnienie działania leków?

Kluczem do zrozumienia synergizmu jest analiza stresu replikacyjnego. Karboplatyna, tworząc addukty z DNA, wywołuje stres replikacyjny charakteryzujący się zatrzymaniem cyklu komórkowego w fazie S/G2 i aktywacją kinazy Chk1 przez fosforylację na serynie 345. Chlorochina nasila ten efekt poprzez dodatkowy mechanizm: hamowanie biosyntezy nukleotydów de novo.

Analiza cyklu komórkowego wykazała różnice czasowe między liniami. W MCF7 kombinacja karboplatyny i CQ powodowała zatrzymanie głównie w fazie S już po 24h, podczas gdy sama karboplatyna indukowała zatrzymanie w S/G2. W 48h obie grupy (karboplatyna i kombinacja) wykazywały głównie zatrzymanie w G2/M z wyraźnym wzrostem frakcji subG1 w grupie kombinowanej – co korelowało z danymi o apoptozie. W linii SKBR3 efekt był opóźniony: wyraźną indukcję fazy S w grupie kombinowanej obserwowano dopiero w 48h po leczeniu.

Western blot potwierdził znaczący wzrost poziomu fosforylowanej kinazy Chk1 (Ser345) w komórkach traktowanych kombinacją leków w porównaniu do monoterapii. Marker autofagii LC3A/B służył jako kontrola potwierdzająca, że CQ rzeczywiście działa jako inhibitor lizosomalny. Analogiczne wyniki uzyskano dla kombinacji cisplatyny z CQ w linii MCF7.

Eksperyment ratunkowy dostarczył bezpośredniego dowodu na mechanizm działania CQ: suplementacja zewnętrznymi deoksynukleotydami (dNTP, 20 µM) częściowo przywracała zdolność komórek do formowania kolonii po leczeniu kombinacją karboplatyny i CQ. Efekt ten był szczególnie wyraźny w linii MCF7 i SKBR3, co wskazuje, że przynajmniej część fenotypu komórkowego wywoływanego przez CQ wynika z inhibicji biosyntezy nukleotydów.

Czy chlorochina wzmacnia działanie inhibitorów odpowiedzi na stres replikacyjny?

Autorzy zbadali również, czy CQ może potęgować efekt inhibitorów kinaz ATR (ceralasertib) i Chk1 (prexasertib), które są obecnie w fazie badań klinicznych jako adiuwanty do chemioterapii. Głównym problemem tych leków jest wysoka toksyczność wymagająca dużych dawek dla osiągnięcia efektu terapeutycznego.

Wyniki eksperymentów z kombinacjami trójskładnikowymi (karboplatyna + ATRi/Chk1i + CQ) wykazały całkowite zniesienie zdolności komórek do ponownej proliferacji po leczeniu – podczas gdy kombinacje dwuskładnikowe (karboplatyna + ATRi/Chk1i lub karboplatyna + CQ) pozwalały części komórek na przeżycie i tworzenie kolonii.

Analiza cyklu komórkowego pokazała, że dodanie CQ do kombinacji karboplatyny z ATRi/Chk1i zwiększało odsetek komórek w fazie S w porównaniu do grup bez CQ. W linii SKBR3 zaobserwowano również redukcję fazy G2/M w obecności CQ. Szczególnie interesujący był synergizm między inhibitorem Chk1 a CQ w indukcji fazy S w komórkach SKBR3.

Western blot ujawnił znaczący wzrost poziomu p-Chk1 (Ser345) w grupach trójskładnikowych w porównaniu do grup bez CQ – zarówno w MCF7, jak i SKBR3. Co ciekawe, inhibitor Chk1 sam w sobie powodował silną indukcję fosforylacji Chk1 (zgodnie z danymi literaturowymi), ale dodanie CQ dodatkowo zwiększało ten efekt w kombinacjach z karboplatyną.

Badacze przetestowali również kombinacje CQ z ATRi/Chk1i bez karboplatyny (monoterapia inhibitorami RSR). W linii MCF7 dodanie CQ całkowicie blokowało ponowną proliferację po leczeniu inhibitorami. Efekt był jednak zależny od typu komórek – w linii SKBR3 dodanie CQ do ATRi powodowało jedynie niewielkie zmniejszenie liczby formowanych kolonii, mimo wyraźnej indukcji fazy S i wzrostu p-Chk1.

Eksperyment ratunkowy z dNTP potwierdził, że w MCF7 suplementacja nukleotydami częściowo przywracała zdolność do proliferacji po leczeniu kombinacjami z CQ. W SKBR3 efekt ratunkowy był widoczny tylko dla kombinacji karboplatyny z CQ, ale nie dla trójskładnikowych układów z inhibitorami RSR – prawdopodobnie ze względu na zbyt silny stres replikacyjny.

Czy efekt chlorochiny jest specyficzny dla raka piersi?

Aby wykazać, że mechanizm działania CQ nie jest ograniczony do nowotworów piersi, autorzy przeprowadzili analogiczne eksperymenty na linii HCT116 (rak jelita grubego). Kombinacja 80 µM karboplatyny z 40 µM CQ skutkowała całkowitą inhibicją formowania kolonii oraz znaczącym wzrostem apoptozy już od 24h po leczeniu.

Analiza cyklu komórkowego w HCT116 wykazała indukcję fazy G1 (nie S) po 24h w grupach z CQ, podczas gdy sama karboplatyna powodowała zatrzymanie w fazie S. Po 48h około połowa populacji komórek w grupach z CQ znajdowała się w fazie subG1, co korelowało z danymi o apoptozie. Analiza żywych komórek ujawniła, że kombinacja CQ z karboplatyną indukowała fazę S w większym stopniu niż sama karboplatyna (która powodowała głównie zatrzymanie w G2/M).

Western blot potwierdził wzrost p-Chk1 (Ser345) w komórkach HCT116 traktowanych kombinacją – efekt był silniejszy niż w przypadku monoterapii karboplatyną i pojawił się w 48h (korelując z indukcją fazy S), podczas gdy w grupie z samą karboplatyną maksimum fosforylacji obserwowano już w 24h.

Autorzy przetestowali również inny inhibitor lizosomalny – chlorek amonu (NH₄Cl). Kombinacja NH₄Cl z karboplatyną również hamowała ponowną proliferację komórek, indukowała fazę G1/S i zwiększała poziom p-Chk1 – co potwierdza, że obserwowane efekty wynikają z inhibicji funkcji lizosomalnych, a nie są specyficzne wyłącznie dla chlorochiny.

Co te odkrycia mogą oznaczać dla praktyki onkologicznej?

Wyniki badań sugerują, że dodanie niskodawkowej chlorochiny do standardowej chemioterapii lekami platynowymi może pozwolić na redukcję dawek tych ostatnich bez utraty skuteczności terapeutycznej. To szczególnie istotne w kontekście toksyczności karboplatyny – trombocytopenii, neutropenii i niedokrwistości spowodowanych mielosupresją. Obniżenie dawki karboplatyny przy jednoczesnym zachowaniu lub zwiększeniu efektu przeciwnowotworowego mogłoby znacząco poprawić jakość życia pacjentów.

Chlorochina w zalecanych dawkach terapeutycznych jest stosunkowo bezpieczna. Krótkotrwałe stosowanie może powodować działania niepożądane ze strony przewodu pokarmowego (nudności, wymioty, biegunka), natomiast długotrwałe lub w wysokich dawkach – retinopatię, kardiotoksyczność i neurotoksyczność. Większość tych działań jest odwracalna po przerwaniu leczenia. Co istotne, CQ ma wąskie okno terapeutyczne i nie wykazuje dobrej skuteczności jako pojedynczy lek chemioterapeutyczny – stąd priorytetem jest jej stosowanie w kombinacji z lekami genotoksycznymi.

Szczególnie obiecujące jest połączenie CQ z inhibitorami RSR (ATRi, Chk1i). Prexasertib (inhibitor Chk1) wykazywał dobrą aktywność przeciwnowotworową w badaniach przedklinicznych, ale w badaniach klinicznych fazy I/III odnotowano poważne działania niepożądane. Ceralasertib (inhibitor ATR) jest lepiej tolerowany, ale wymaga optymalizacji dawkowania – zarówno przedłużone leczenie, jak i zwiększenie dawki powodują efekty uboczne. Dodanie CQ do tych kombinacji mogłoby umożliwić stosowanie niższych dawek inhibitorów przy zachowaniu lub zwiększeniu skuteczności.

Autorzy proponują strategię wielolekowej terapii niskodawkowej (MLD – multiple-low-dose therapy), która pozwala przezwyciężyć oporność na pojedyncze leki i zmniejszyć toksyczność poprzez redukcję dawek terapeutycznych. Chlorochina, nasilając stres replikacyjny, może wykazywać synergizm nie tylko z lekami platynowymi i inhibitorami RSR, ale potencjalnie również z innymi lekami targetującymi szlaki odpowiedzi na stres replikacyjny: analogami nukleozydowymi (gemcytabina, 5-fluorouracyl), lekami alkilującymi (cyklofosfamid, dakarbazyna, temozolomid), inhibitorami topoizomeraz I i II (doksorubicyna, etopozyd) oraz inhibitorami PARP.

Należy jednak podkreślić, że wszystkie opisane wyniki pochodzą z badań in vitro na liniach komórkowych. Nie wiadomo, czy efekty te będą replikowalne w warunkach in vivo i w badaniach klinicznych. Konieczna jest ocena bezpieczeństwa kombinacji pod kątem nakładających się toksyczności – zarówno CQ, jak i leki platynowe mogą powodować działania niepożądane ze strony przewodu pokarmowego.

Czy chlorochina może zmienić standardy chemioterapii nowotworów?

Badania in vitro wykazały, że chlorochina w niskich dawkach (15-40 µM) synergistycznie wzmacnia działanie leków platynowych (karboplatyna, cisplatyna) oraz inhibitorów odpowiedzi na stres replikacyjny (ATRi, Chk1i) w komórkach nowotworowych raka piersi i jelita grubego. Mechanizm działania opiera się na nasileniu stresu replikacyjnego poprzez zmniejszenie dostępności nukleotydów niezbędnych do syntezy DNA, co prowadzi do zwiększonej fosforylacji kinazy Chk1, zatrzymania cyklu komórkowego i masowej apoptozy.

Kluczowym odkryciem jest całkowite zniesienie zdolności komórek nowotworowych do ponownej proliferacji po leczeniu kombinacjami z chlorochiną – podczas gdy monoterapia lekami platynowymi lub inhibitorami RSR pozwalała części komórek na przeżycie i tworzenie kolonii. Efekt ten może mieć istotne znaczenie kliniczne, umożliwiając redukcję dawek chemioterapeutyków przy zachowaniu lub zwiększeniu skuteczności leczenia oraz zmniejszeniu toksyczności.

Strategia wielolekowej terapii niskodawkowej z udziałem chlorochiny wymaga jednak potwierdzenia w badaniach na zwierzętach i w próbach klinicznych. Szczególnie istotna będzie ocena bezpieczeństwa długoterminowego stosowania kombinacji oraz identyfikacja grup pacjentów, które mogłyby odnieść największe korzyści z takiego podejścia terapeutycznego. Jeśli wyniki zostaną potwierdzone w warunkach klinicznych, chlorochina – tani i dostępny lek o ustalonej tolerancji – może stać się wartościowym adiuwantem w leczeniu onkologicznym.