CQ i HCQ jako nowa nadzieja w terapii raka pęcherza moczowego

Czy CQ i HCQ mogą rewolucjonizować leczenie raka pęcherza?

Chlorochina (CQ) i hydroksychlorochina (HCQ) to powszechnie stosowane leki przeciwmalaryczne, które wykazują również aktywność przeciwnowotworową. Wyniki licznych badań potwierdzają ich skuteczność w walce z różnymi typami nowotworów, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej toksyczności wobec prawidłowych komórek nabłonkowych. CQ i HCQ są znane z hamowania autofagii indukowanej przez leki przeciwnowotworowe, co zwiększa ich skuteczność terapeutyczną. Obecnie prowadzone są liczne badania kliniczne oceniające efekty stosowania tych związków samodzielnie lub w połączeniu z innymi lekami przeciwnowotworowymi w różnych typach nowotworów.

Rak pęcherza moczowego jest jednym z najczęstszych nowotworów urologicznych, występującym głównie u mężczyzn. Rak ograniczony do narządu może być leczony operacyjnie poprzez przezcewkową resekcję lub radykalną cystektomię. Natomiast w przypadku zaawansowanego lub przerzutowego raka pęcherza standardem postępowania jest chemioterapia systemowa oparta na cisplatynie, znana jako schemat MVAC (metotreksat, winblastyna, doksorubicyna i cisplatyna). Odsetek odpowiedzi na chemioterapię MVAC wynosi około 66-77%, jednak potrzebne są nowe metody leczenia ze względu na ograniczoną skuteczność dostępnych terapii. W Europie dla pacjentów z zaawansowanym rakiem pęcherza opornym na związki platyny zatwierdzono winflunine, inhibitor mikrotubul, jako leczenie drugiego rzutu, jednak jego skuteczność jest umiarkowana.

Autofagia jest procesem przeżyciowym komórek w trudnych warunkach środowiskowych, takich jak głodzenie. Jest to złożony proces molekularny, który uczestniczy nie tylko w samoobronie komórek, ale również w procesach infekcji, apoptozy i zachowaniach komórek nowotworowych. Manipulacja procesem autofagii w komórkach nowotworowych może zwiększać i promować odpowiedź na leczenie przeciwnowotworowe. Badania na komórkach niedrobnokomórkowego raka płuca wykazały, że hamowanie autofagii prowadzi do nasilenia apoptozy poprzez reaktywne formy tlenu. CQ i HCQ blokują zakwaszenie lizosomów, degradację autofagosomów i inaktywują autofagię, co zmniejsza przeżywalność komórek nowotworowych.

Jakie mechanizmy działania wykazują CQ i HCQ w badaniach in vitro?

W przeprowadzonym badaniu oceniono wpływ CQ i HCQ na proliferację komórek ludzkiego raka pęcherza moczowego poprzez hamowanie autofagii i indukcję apoptozy. Badanie obejmowało analizę żywotności komórek, tworzenie kolonii, ocenę autofagii oraz apoptozy w komórkach raka pęcherza o różnym stopniu złośliwości (RT4, 5637, T24) oraz w niezmienionej linii komórek nabłonka dróg moczowych (SV-Huc-1). Dodatkowo porównano wpływ tych związków na komórki raka pęcherza z ich wpływem na komórki raka prostaty (PC3) i raka piersi (MCF-7).

Wyniki badania wykazały, że CQ i HCQ znacząco zmniejszały żywotność komórek raka pęcherza moczowego w sposób zależny od dawki i czasu. Żywotność komórek SV-Huc-1 eksponowanych na 25 μM CQ i 20 μM HCQ przez 24 godziny wynosiła odpowiednio 92,49% i 94,08%, natomiast w komórkach raka pęcherza wartości te były niższe: 91,78% i 93,41% dla RT4, 79,37% i 82,84% dla 5637 oraz 77,35% i 81,19% dla T24. Ponadto, tworzenie kolonii przez komórki raka pęcherza 5637 i T24 było znacząco hamowane w obecności CQ lub HCQ, podczas gdy komórki SV-Huc-1 traktowane tymi związkami wykazywały wysoki wskaźnik tworzenia kolonii. Dodatkowo, leczenie inhibitorami autofagii, w tym CQ lub HCQ, przez 24 godziny skutkowało znacznie zmniejszoną żywotnością komórek T24 i SV-Huc-1 w porównaniu z komórkami PC3 i MCF-7, które wykazywały niską podstawową aktywność autofagiczną.

W badaniu wykazano również, że CQ i HCQ blokują podstawową autofagię w komórkach ludzkiego raka pęcherza moczowego poprzez hamowanie degradacji autofagolizosomów. Zaobserwowano zwiększoną akumulację białek p62 i LC3-II w komórkach SV-Huc-1, 5637 i T24 odpowiadającą zwiększonym stężeniom CQ i HCQ. Ponadto, komórki traktowane 25 μM CQ przez 24, 48 i 72 godziny również wykazywały akumulację białek p62 i LC3-II. Wyniki te sugerują, że CQ lub HCQ blokują autofagiczny przepływ, który ułatwia degradację białek związanych z autofagosomami, poprzez hamowanie fuzji lizosomów.

Aby dokładniej wyjaśnić wpływ CQ i HCQ na podstawową aktywność autofagiczną w komórkach ludzkiego raka pęcherza moczowego, zmierzono tworzenie punktów LC3 w komórkach za pomocą immunofluorescencji. Zaobserwowano zwiększenie liczby punktów LC3 w komórkach 5637 i T24 w warunkach głodzenia. Gdy komórki były traktowane CQ i HCQ, które blokują fuzję autofagosom-lizosom, liczba punktów LC3 znacząco wzrosła. Przy użyciu barwnika akrydyny pomarańczowej (AO), hydrofobowej zielonej cząsteczki fluorescencyjnej emitującej jasną czerwoną fluorescencję w kwaśnych pęcherzykach, stwierdzono, że czerwona fluorescencja zwiększała się w sposób zależny od dawki w komórkach 5637 i T24 traktowanych CQ lub HCQ. Dane te wykazały, że barwienie AO może nie być odpowiednie do oceny indukcji autofagii poprzez tworzenie kwaśnych organelli pęcherzykowych (AVO) w komórkach raka pęcherza traktowanych CQ lub HCQ. Niemniej jednak, akumulacja czerwonej fluorescencji wyraźnie wskazywała, że leczenie CQ lub HCQ celuje w lizosomy w komórkach ludzkiego raka pęcherza.

Badanie wykazało również, że hamowanie podstawowej autofagii przez CQ i HCQ indukuje apoptozę w komórkach ludzkiego raka pęcherza moczowego. Aktywność kaspazy 3/7 była zwiększona w komórkach T24 traktowanych 25 μM CQ lub 20 μM HCQ przez 24 godziny, podczas gdy aktywność kaspazy 3/7 zaczynała wzrastać w komórkach SV-Huc-1, PC3 i MCF-7, gdy czas ekspozycji został wydłużony do 72 godzin. Aktywność kaspazy 3/7 po 24 godzinach i 72 godzinach od leczenia była wyższa w komórkach T24 traktowanych 25 μM CQ i 20 μM HCQ niż w komórkach SV-Huc-1. Poziomy rozciętego PARP (c-PARP) i rozciętej kaspazy 3 (c-Cas3) były zwiększone w komórkach raka pęcherza wraz ze zwiększoną dawką CQ lub HCQ i czasem ekspozycji. Jednak w komórkach SV-Huc-1 można je było wykryć tylko po ekspozycji na 25 μM CQ przez 48 godzin i na 20 μM HCQ przez 72 godziny.

Dodatkowo wykryto stopnie fragmentacji DNA w celu monitorowania indukcji apoptozy w komórkach T24 eksponowanych na CQ lub HCQ przez 24 godziny. Wyniki wykazały zwiększony poziom apoptozy w komórkach T24 po leczeniu CQ i HCQ. Łącznie wyniki te wykazały, że samo CQ lub HCQ hamuje podstawową autofagię i indukuje apoptozę w komórkach ludzkiego raka pęcherza moczowego.

Czy znane wskazania CQ i HCQ sugerują nowe strategie terapeutyczne?

Zarówno CQ jak i HCQ jako leki przeciwmalaryczne były historycznie stosowane z powodzeniem w leczeniu tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i reumatoidalnego zapalenia stawów. HCQ jest preferowanym lekiem w SLE, gdzie lepiej kontroluje powikłania dermatologiczne, obniża częstość występowania działań niepożądanych ze strony przewodu pokarmowego i zmniejsza ryzyko działań niepożądanych ze strony oczu w porównaniu z CQ. Właściwości lizosomotropowe zostały wykorzystane do przedefiniowania CQ i jego pochodnych jako inhibitorów autofagii w późnej fazie. CQ blokuje autofagię poprzez hamowanie proteaz lizosomalnych i zapobieganie fuzji autofagosom-lizosom, stając się najczęściej stosowanym lekiem do hamowania autofagii w podstawowych badaniach naukowych.

Warto zauważyć, że terapeutyczna dawka CQ w osoczu wynosi około 2,5-5,0 ml/l, co odpowiada 4,85-9,69 μM. Dawka śmiertelna wynosiła 11 mg/l. Według uzyskanych wyników, osiągnięcie najbardziej skutecznej dawki CQ może być śmiertelne dla pacjentów. Jednak można rozważyć instylację dopęcherzową w celu utrzymania wysokich stężeń w pęcherzu, aby uniknąć ogólnoustrojowych skutków ubocznych, jak opisano wcześniej w leczeniu tocznia rumieniowatego układowego i reumatoidalnego zapalenia stawów. Dalsze badania nad połączeniem umiarkowanej dawki CQ lub HCQ z innymi lekami to kolejny kierunek, aby uniknąć toksyczności. Konieczny jest nowy inhibitor autofagii o niższej toksyczności.

Czy modulacja autofagii otwiera nowe możliwości w leczeniu raka?

Autofagia jest obecnie znana jako proces mechanizmu przeżycia komórek napotykających trudne wyzwania środowiskowe, takie jak głodzenie. W procesie autofagii uczestniczy stopniowa i złożona sygnalizacja molekularna, aby osiągnąć to zjawisko. Sugeruje się, że autofagia jest zaangażowana nie tylko w samoochronę, ale także w zakażenia, apoptozę i zachowania nowotworowe. Wykazano, że manipulacja autofagią w komórkach nowotworowych wzmacnia i promuje odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe.

W komórkach eukariotycznych podstawowa konstytutywna autofagia jest zaangażowana w usuwanie agregatów białkowych, które tworzą się w komórkach w wyniku starzenia się, stresu oksydacyjnego i innych zmian. W komórkach raka pęcherza traktowanych CQ i HCQ, akumulacja p62 i przetwarzanie LC3-II wzrastały w sposób zależny od dawki i czasu. Akumulację punktów LC3 obserwowano w komórkach traktowanych CQ i HCQ. Wyniki te wskazywały, że te inhibitory autofagii skutecznie blokują autofagię, zapobiegając fuzji autofagosom-lizosom, co prowadzi do zahamowania degradacji p62 i LC3-II.

Podsumowując, CQ i HCQ skutecznie hamowały podstawową autofagię w komórkach raka pęcherza moczowego, co z kolei zmniejszało żywotność w modelu komórkowym. Efekty CQ i HCQ były szczególnie widoczne w komórkach raka pęcherza. Utrata żywotności komórek była prawdopodobnie spowodowana dysfunkcją lizosomalną, co ostatecznie powodowało apoptozę komórek nowotworowych. Można oczekiwać zastosowania klinicznego jako opcji leczenia podstawowego lub wspomagającego w terapii raka pęcherza moczowego.

Podsumowanie

Chlorochina i hydroksychlorochina wykazują znaczący potencjał w leczeniu raka pęcherza moczowego poprzez hamowanie procesu autofagii w komórkach nowotworowych. Badania laboratoryjne potwierdziły, że związki te skutecznie zmniejszają żywotność komórek rakowych w sposób zależny od dawki i czasu, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej toksyczności wobec zdrowych komórek nabłonkowych. Mechanizm działania polega na blokowaniu zakwaszenia lizosomów i degradacji autofagosomów, co prowadzi do śmierci komórek nowotworowych. Szczególnie obiecujące wyniki zaobserwowano w komórkach raka pęcherza w porównaniu z innymi typami nowotworów. Mimo że terapeutyczne dawki systemowe mogą być ograniczone ze względu na potencjalną toksyczność, rozważa się możliwość miejscowego podawania leków poprzez instylację dopęcherzową. Wyniki badań sugerują, że CQ i HCQ mogą stanowić wartościową opcję w podstawowym lub wspomagającym leczeniu raka pęcherza moczowego.