HMGB1 kluczem do leczenia degeneracji dysków międzykręgowych

Czy kluczowe mechanizmy degeneracji dysków są już znane?

Badacze z Korei Południowej dostarczyli nowych dowodów na temat kluczowego mechanizmu związanego z degeneracją dysków międzykręgowych (IVD), która jest główną przyczyną bólu szyi i pleców u dorosłych. Ich odkrycia mogą mieć istotne znaczenie dla opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Dyski międzykręgowe, umieszczone między kręgami, zapewniają elastyczność kręgosłupa i absorbują obciążenia mechaniczne. Każdy dysk składa się z trzech głównych elementów: zewnętrznego pierścienia włóknistego (AF), centralnego jądra miażdżystego (NP) oraz dwóch chrząstkowych płytek końcowych łączących się z sąsiednimi kręgami. Co istotne, IVD są największymi tkankami beznaczyniowymi w ludzkim organizmie, co sprawia, że są wysoce zależne od dyfuzji składników odżywczych.

Jak wyjaśniają badacze, składniki odżywcze pochodzą z naczyń włosowatych w trzonie kręgu, przechodzą przez płytkę podchrzęstną i kończą się w pętlach w pobliżu chrząstkowych płytek końcowych. Stamtąd tlen i glukoza muszą dyfundować przez macierz płytki końcowej, aby podtrzymać komórki w AF i NP. Ten delikatny łańcuch dostaw łatwo ulega zakłóceniom. “Starzenie, przeciążenie mechaniczne, urazy, palenie tytoniu i sklerotyzacja kości podchrzęstnej sprzyjają zwapnieniu płytki końcowej i upośledzają przepływ naczyniowy, ograniczając w ten sposób transport składników odżywczych” – piszą autorzy badania.

Jakie mechanizmy autofagii i rola HMGB1 mają znaczenie?

Zmniejszenie dostępności tlenu i glukozy tworzy hipoksyczne, ubogie w składniki odżywcze mikrośrodowisko, które wywołuje silne komórkowe reakcje stresowe. W takich warunkach komórki NP wykorzystują mechanizmy adaptacyjne, takie jak autofagia – proces zależny od lizosomów, który przetwarza uszkodzone białka i organelle w celu utrzymania homeostazy komórkowej. Odkrycie genów ATG przez Yoshinoriego Ohsumiego, nagrodzone Nagrodą Nobla, ugruntowało znaczenie autofagii jako centralnego mechanizmu przetrwania w warunkach niedoboru składników odżywczych.

Naukowcy zbadali, w jaki sposób niedobór składników odżywczych wpływa na komórki jądra miażdżystego, ze szczególnym uwzględnieniem regulacyjnej roli HMGB1 (High Mobility Group Box 1) w autofagii i apoptozie. HMGB1 w normalnych warunkach fizjologicznych funkcjonuje jako niezwiązane z histonami białko wiążące DNA w jądrze. Jednak podczas stresu przemieszcza się do cytoplazmy lub jest wydzielane pozakomórkowo, gdzie reguluje odpowiedzi stresowe.

W cytoplazmiie HMGB1 wchodzi w interakcję z Beclin-1, zakłócając jego związek z Bcl-2 i tym samym promując tworzenie autofagosomów. Choć początkowo autofagia chroni komórki NP, długotrwała lub nadmierna aktywacja może przesunąć równowagę w kierunku apoptozy, którą charakteryzuje aktywacja kaspaz, kondensacja chromatyny i pęcherzykowanie błony, co ostatecznie przyczynia się do utraty komórek dysku w IVDD.

Jak warunki hodowli wpływają na aktywność komórkową?

W badaniu wykorzystano ludzkie komórki jądra miażdżystego (HNP) pozyskane z biobanku szpitala St. Mary’s w Daejeon. Komórki hodowano w różnych stężeniach składników odżywczych i surowicy (0%, 1% i 10% FBS) przez okres do 48 godzin w warunkach 5% O₂, aby symulować fizjologiczne środowisko komórek NP dysku. Naukowcy oceniali aktywację autofagii poprzez analizę kluczowych markerów, takich jak LC3-II i P62, a także translokację cytoplazmatyczną HMGB1 i jej związek z odpowiedziami komórkowymi na stres.

Badacze badali również progresję apoptozy poprzez aktywację aktywowanej kaspazy-3 i oceniali wpływ hamowania autofagii za pomocą chlorochiny (CQ), w tym jej potencjalne działania poza głównym celem na procesy komórkowe. Do analizy wykorzystano szereg metod, w tym Western blot, barwienie immunofluorescencyjne, cytometrię przepływową (FACS) oraz RT-qPCR.

Wyniki badania wykazały, że niedobór surowicy i składników odżywczych odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu morfologii, proliferacji i aktywności metabolicznej komórek NP. W optymalnych warunkach (10% FBS) komórki zachowywały normalny kształt i funkcje metaboliczne, podczas gdy niedobór surowicy prowadził do postępującego kurczenia się komórek i ich odłączania się, zwłaszcza w HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution).

Spadek aktywności dehydrogenazy i zawartości DNA w warunkach obniżonego poziomu surowicy sugeruje zaburzenia nie tylko w proliferacji komórek, ale także w aktywności metabolicznej. Co ciekawe, aktywność metaboliczna pozostawała stosunkowo stabilna w DMEM-F12 z umiarkowanymi poziomami surowicy (5-20% FBS), podkreślając znaczenie czynników pochodzących z surowicy dla przeżycia komórek.

Co szczególnie ważne, badacze odkryli, że HMGB1 jest istotnym regulatorem autofagii w komórkach HNP w warunkach stresu żywieniowego. Analiza Western blot wykazała, że ekspresja HMGB1 osiągnęła szczyt po 48 godzinach w 0% i 1% FBS, co zbiegło się z podwyższonymi poziomami LC3-II i obniżonymi poziomami SQSTM1/P62 – charakterystycznymi dla aktywnego strumienia autofagicznego. Sugeruje to, że HMGB1 może ułatwiać podtrzymywanie autofagii podczas przedłużającego się niedoboru surowicy.

Natomiast w warunkach 10% FBS, HMGB1 wykazał wczesny szczyt po 12 godzinach, po którym nastąpił spadek, wskazując na przejściową odpowiedź autofagiczną w warunkach bogatych w składniki odżywcze. Dynamika ta odzwierciedla zależną od czasu rolę HMGB1 w modulowaniu autofagii, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami T. Yurube i współpracowników z 2019 roku.

Czy wyniki eksperymentalne zmieniają naszą interpretację IVDD?

“HMGB1 funkcjonuje jako potencjalny przełącznik molekularny między ochronną autofagią a apoptotyczną śmiercią komórki” – zauważają badacze. Ich obserwacje potwierdzają, że reaktywne formy tlenu (ROS), które gromadzą się w warunkach niedoboru składników odżywczych, dodatkowo zwiększają translokację HMGB1 i strumień autofagiczny, jednocześnie uwrażliwiając komórki na apoptozę. Zgodnie z tym, Lee i współpracownicy (2010) donieśli, że gromadzenie się ROS podczas niedoboru surowicy jest silnym czynnikiem wywołującym apoptozę w różnych typach komórek.

Badacze przeprowadzili również analizę Western blot, aby ocenić zależną od czasu aktywność autofagiczną LC3-II, P62 i HMGB1 przy różnych stężeniach surowicy (10%, 1% i 0% FBS) w czasie 12, 24 i 48 godzin, aby zidentyfikować szczytową odpowiedź autofagiczną na niedobór składników odżywczych. Ich wyniki wykazały, że poziomy LC3-II były najwyższe po 48 godzinach w warunkach 0% i 1% FBS, wskazując na maksymalną odpowiedź autofagiczną w tych warunkach.

Ekspresja P62 wykazała tendencję spadkową we wszystkich warunkach surowicowych, dodatkowo wspierając aktywację autofagii poprzez jej degradację. Ekspresja HMGB1 osiągnęła szczyt po 12 godzinach zarówno w 0%, jak i 10% FBS, po czym nastąpił spadek, podczas gdy w 1% FBS poziomy HMGB1 wykazały nieoczekiwany wzrost w czasie.

Badacze wykorzystali również chlorochinę (CQ), zatwierdzoną przez FDA jako lek przeciwmalaryczny, który zyskał uwagę jako inhibitor autofagii. CQ zakłóca zakwaszanie lizosomów, zapobiegając w ten sposób degradacji LC3-II i fuzji autofagosom-lizosom. W badaniu wykazano, że chociaż CQ skutecznie hamowała autofagię, to także znacznie nasilała apoptozę, na co wskazywała zwiększona ekspresja aktywowanej kaspazy-3 w porównaniu z niepoddanymi leczeniu kontrolami.

Efekt ten jest prawdopodobnie związany z zakłóceniem przez CQ zakwaszania lizosomów, co prowadzi do akumulacji LC3-II i upośledzonego usuwania uszkodzonych białek i organelli. Wynikające z tego przeciążenie komórkowe przyczynia się do wyraźnego stresu retikulum endoplazmatycznego (ER), który wraz z dysfunkcją mitochondrialną napędzaną przez ROS może aktywować szlaki apoptotyczne jako mechanizm ochronny przed przeżyciem uszkodzonych komórek.

Co ważne, nie wykazuje to koniecznie bezpośredniego związku przyczynowego między autofagią a apoptozą w warunkach niedoboru składników odżywczych, gdzie autofagia normalnie postępuje. Aby rozwiązać ten problem, badacze rozważyli możliwe działania CQ poza głównym celem i wyjaśnili, że obserwowany wzrost apoptozy może odzwierciedlać takie efekty.

Dodatkowo, barwienie immunofluorescencyjne dla LC3 i SQSTM1/P62 potwierdziło te obserwacje. Komórki pozytywne dla LC3 osiągnęły szczyt przy 0% FBS i zmniejszały się wraz ze wzrostem stężenia surowicy, podczas gdy komórki pozytywne dla SQSTM1/P62 wykazywały odwrotną tendencję – najwyższe przy 10% FBS i najniższe przy 0% FBS. Ten wzorzec potwierdza, że niedobór surowicy silnie indukuje autofagię, prowadząc do zwiększonej degradacji SQSTM1/P62.

Analiza RT-qPCR genów związanych z autofagią ujawniła znaczną regulację w górę LC3 i regulację w dół p62 na poziomie mRNA wraz ze zmniejszającym się stężeniem surowicy, osiągając szczyt przy 0% FBS i najniższe poziomy przy 10% FBS. Ta odpowiedź transkrypcyjna sugeruje, że niedobór surowicy nie tylko aktywuje strumień autofagiczny, ale także moduluje ekspresję genów, aby podtrzymać autofagię.

Obserwacje immunofluorescencyjne wykazały, że znaczny wzrost komórek pozytywnych dla aktywowanej kaspazy-3 wraz ze zmniejszającym się stężeniem FBS wskazuje na indukcję apoptozy w odpowiedzi na komórki NP w warunkach niedoboru surowicy. Najwyższe poziomy apoptozy obserwowano przy 0% FBS, a najniższe przy 10% FBS po 48 godzinach.

Dalsze potwierdzenie apoptozy poprzez analizę FACS wykazało zwiększony odsetek komórek apoptotycznych w warunkach obniżonego poziomu surowicy, z najwyższym odsetkiem przy 0% FBS. Tendencja ta odzwierciedla ustalenia C. Q. Zhao i współpracowników (2006), którzy wykazali, że komórki NP ulegają znacznej apoptozy w warunkach ubogich w składniki odżywcze, nasilając IVDD.

Analiza RT-qPCR ujawniła również stopniowy wzrost ekspresji kaspazy-3 wraz ze zmniejszającymi się stężeniami surowicy, osiągając najwyższy poziom w warunkach całkowitego niedoboru surowicy (0% FBS). Wskazuje to na silny związek między głodzeniem surowicowym a apoptozą w komórkach NP, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami w chondrocytach przez Jia i współpracowników (2018).

Wyniki te mają istotne znaczenie kliniczne, ponieważ IVDD rozwija się w mikrośrodowisku charakteryzującym się przewlekłym niedoborem składników odżywczych, hipoksją i stanem zapalnym, które wspólnie przyspieszają śmierć komórek NP i rozpad macierzy zewnątrzkomórkowej. Strategie, które mogą przywrócić homeostazę i utrzymać żywotność komórek NP, są zatem wysoce istotne dla terapii modyfikujących przebieg choroby.

Czy odkrycia otwierają nowe drogi terapeutyczne?

Czy odkrycia te mogą prowadzić do nowych strategii terapeutycznych w leczeniu bólu kręgosłupa? Badacze sugerują, że środki farmakologiczne, takie jak rapamycyna i jej analogi, wykazały zdolność do zwiększania autofagii, tłumienia apoptozy i opóźniania degeneracji dysków w modelach przedklinicznych. Równolegle, pojawiające się podejścia oparte na edycji genów i interferencji RNA ukierunkowane na HMGB1 stanowią obiecujące drogi do precyzyjnego dostrajania równowagi między autofagią a apoptozą.

Badanie podkreśla rolę HMGB1 jako kluczowego molekularnego przełącznika regulującego los komórek NP w warunkach stresu żywieniowego i podkreśla jego potencjał jako celu terapeutycznego w IVDD. Wzmocnienie ochronnej autofagii lub zapobieganie przesunięciom apoptotycznym napędzanym przez HMGB1 może pomóc w zachowaniu przeżycia komórek dysku i spowolnieniu degeneracji.

Jakie wyzwania stoją przed przyszłymi badaniami?

Ograniczeniem tego badania jest brak bezpośredniej walidacji mechanistycznej poprzez wyciszenie HMGB1, nadekspresję lub barwienie immunofluorescencyjne, co powinno być zbadane w przyszłych badaniach. Aby rozwiązać to ograniczenie, badacze dostosowali swoje stwierdzenia do wcześniej opublikowanych badań i cytowali odpowiednie odniesienia, które wspierają ich wnioski.

Podsumowując, niedobór surowicy wywołuje zależną od czasu interakcję między autofagią a apoptozą w ludzkich komórkach jądra miażdżystego, orkiestrowaną przez HMGB1. Zahamowanie autofagii za pomocą chlorochiny dodatkowo wzmacnia apoptozę, podkreślając krytyczną równowagę między tymi szlakami. Zrozumienie tej równowagi może kierować ukierunkowanymi terapiami dla IVDD.

Podsumowanie

Badacze z Korei Południowej zidentyfikowali kluczowy mechanizm degeneracji dysków międzykręgowych, który może otworzyć drogę do nowych strategii terapeutycznych w leczeniu bólu kręgosłupa. Dyski międzykręgowe, jako największe tkanki beznaczyniowe w organizmie, są wysoce zależne od dyfuzji składników odżywczych z naczyń włosowatych w trzonie kręgu. Ten delikatny łańcuch dostaw łatwo ulega zakłóceniom przez starzenie, przeciążenie mechaniczne, urazy czy palenie tytoniu, co prowadzi do hipoksycznego mikrośrodowiska ubogiego w składniki odżywcze. W takich warunkach komórki jądra miażdżystego aktywują autofagię jako mechanizm przetrwania, a kluczową rolę regulacyjną odgrywa białko HMGB1, które funkcjonuje jako molekularny przełącznik między ochronną autofagią a apoptotyczną śmiercią komórki. Badanie wykazało, że niedobór surowicy i składników odżywczych wywołuje zależną od czasu interakcję między tymi procesami, przy czym ekspresja HMGB1 osiąga szczyt w warunkach stresu żywieniowego. Długotrwała lub nadmierna aktywacja autofagii może przesunąć równowagę w kierunku apoptozy, co przyczynia się do utraty komórek dysku i postępu degeneracji. Wyniki sugerują, że środki farmakologiczne modulujące aktywność HMGB1, takie jak rapamycyna, oraz podejścia oparte na edycji genów mogą stanowić obiecujące drogi terapeutyczne. Zrozumienie równowagi między autofagią a apoptozą w komórkach dysków międzykręgowych może pomóc w opracowaniu terapii modyfikujących przebieg choroby i spowolnieniu degeneracji dysków, która jest główną przyczyną bólu szyi i pleców u dorosłych.