Jakie są nowe mechanizmy oporności na PPQ?
Badanie eksperymentalne przeprowadzone na modelu mysim Plasmodium berghei dostarczyło nowych informacji na temat mechanizmów oporności na piperaquine (PPQ) – kluczowy składnik terapii skojarzonej opartej na artemizynie (ACT), stosowanej w leczeniu malarii. Naukowcy wykorzystali metodę CRISPR/Cas9 do stworzenia linii pasożytów P. berghei z wyższym wskaźnikiem mutacji (PbMut), co pozwoliło na identyfikację mutantów o zmniejszonej podatności na PPQ.
Badanie skupiło się na szczepach pasożytów P. berghei, które poddawano serii sześciu rund ekspozycji na wzrastające dawki PPQ (od 10 mg/kg/dzień do 30 mg/kg/dzień). W wyniku tego procesu selekcyjnego wyizolowano pięć klonów (PbMut-P6-C1 do -C5), które wykazywały zmniejszoną podatność na PPQ w porównaniu z dzikim typem pasożyta (PbWT). Wszystkie klony wykazywały zdolność przeżycia pod wpływem ciśnienia lekowego PPQ, co potwierdziło fenotyp oporności.
Analiza genomowa wyizolowanych klonów opornych na PPQ ujawniła pięć wspólnych mutacji typu SNP (pojedyncze polimorfizmy nukleotydowe). Wśród nich zidentyfikowano mutacje w genach: zinc-carboxypeptidase, sporozoite invasion-associated protein 1, conserved Plasmodium protein, NAD(P) transhydrogenase oraz chloroquine resistance transporter. Szczególną uwagę zwrócono na mutację nonsensowną w genie PbCRT (chloroquine resistance transporter), powodującą przedwczesne zakończenie translacji białka (Y119\*). Białko PbCRT jest transporterem błonowym z przewidywanymi 10 domenami transbłonowymi, a zidentyfikowana mutacja powoduje utratę około 70% białka, zachowując jedynie dwie pierwsze domeny transbłonowe. Ta drastyczna modyfikacja sugerowała, że białko może stracić swoją funkcję transportową.
- Zidentyfikowano pięć klonów P. berghei wykazujących oporność na piperaquine (PPQ)
- Wykryto mutację nonsensowną w genie PbCRT prowadzącą do utraty około 70% białka
- Gen PbCRT okazał się nieistotny dla przeżycia P. berghei, w przeciwieństwie do P. falciparum
- Utrata funkcji PbCRT koreluje ze zmniejszoną podatnością na PPQ
- Pasożyty bez PbCRT wykazują niższy poziom parasitemii i zmiany morfologiczne
Czy utrata PbCRT zmienia dynamikę infekcji?
W kolejnym etapie badania, naukowcy całkowicie usunęli gen PbCRT z genomu pasożyta, tworząc linię PbCRT(−). Co zaskakujące, pasożyty te były zdolne do przeżycia, co wskazuje, że PbCRT nie jest genem niezbędnym dla P. berghei. Jest to odkrycie kontrastujące z dotychczasowymi doniesieniami sugerującymi kluczową rolę tego genu. Próby wprowadzenia analogicznej mutacji (R122\*) do PfCRT u ludzkiego patogenu P. falciparum były nieskuteczne, co potwierdza, że PfCRT pozostaje genem niezbędnym dla tego gatunku.
Badacze porównali PbCRT(−) z PbWT pod względem fenotypu i fitness. Pasożyty pozbawione PbCRT wykazywały konsekwentnie niższy poziom parasitemii w porównaniu z typem dzikim. Obserwacje morfologiczne ujawniły powiększone przezroczyste wakuole w trofozoitach, schizontach i gametocytach PbCRT(−). Podobne nieprawidłowości morfologiczne obserwowano wcześniej w PPQ-opornych pasożytach P. falciparum z mutacją PfCRT F145I oraz w pasożytach z obniżoną ekspresją PfCRT.
Ocena fitness PbCRT(−) w komarach wykazała znacząco niższą liczbę oocyst w jelicie środkowym oraz sporozoitów w gruczołach ślinowych w porównaniu z PbWT. Okres przedpatentny (czas do wykrycia zakażonych erytrocytów po karmieniu komarów) był istotnie dłuższy u myszy zakażonych PbCRT(−) (5,4 dni) niż u myszy zakażonych PbWT (3,6 dni). Te wyniki wskazują, że brak PbCRT wpływa na fitness pasożyta zarówno w stadiach krwi, jak i w stadiach rozwojowych w komarze.
Odkryto nowy mechanizm oporności na leki przeciwmalaryczne, polegający na całkowitej utracie funkcji genów nieistotnych dla przeżycia pasożyta. To przełomowe odkrycie kontrastuje z dotychczas znanymi mechanizmami oporności, które opierały się głównie na mutacjach zmiany sensu w genach niezbędnych lub zwiększeniu liczby ich kopii. Zrozumienie tych różnic między gatunkami Plasmodium może być kluczowe dla opracowania skuteczniejszych strategii terapeutycznych w leczeniu malarii.
Jak zmieniają się strategie leczenia malarii w świetle nowych odkryć?
Kluczowym odkryciem było wykazanie, że całkowite usunięcie PbCRT koreluje ze zmniejszoną podatnością na PPQ. Myszy zakażone PbCRT(−) lub PbMut-P6-C1 i leczone PPQ wykazywały wyższe poziomy parasitemii niż myszy zakażone PbWT. Sugeruje to, że utrata funkcji PbCRT może być nowym mechanizmem oporności na PPQ.
Warto zauważyć, że dotychczasowe badania nad mechanizmami oporności na leki przeciwmalaryczne koncentrowały się głównie na mutacjach zmiany sensu w genach niezbędnych, takich jak PfCRT, DHFR-ts i DHPS, lub na zwiększeniu liczby kopii genów PfMDR1 i plasmepsin II i III. Ten typ nabywania oporności na leki określa się jako “zyskanie funkcji”. Alternatywnym mechanizmem jest nabywanie oporności poprzez zmniejszenie funkcji produktów genowych, jak w przypadku mutacji w genie kelch13, która nadaje oporność na artemizininę poprzez zmniejszenie aktywności pobierania hemoglobiny.
Badanie to pokazuje, że PbCRT nie jest genem niezbędnym, a PbCRT(−) reprezentuje całkowitą utratę funkcji. Podobne przykłady były dotychczas zgłaszane tylko dla mutacji w genach Pfact i jego ortologu Pbact w P. berghei, odkrytych podczas badań z imidazolopiperazyną. Mutanty wykazujące oporność na ten lek posiadają liczne kodony stop w tych genach, co sugeruje, że produkty genów mogą tracić swoją funkcję.
To badanie dostarcza nowego spojrzenia na mechanizmy oporności na leki przeciwmalaryczne, wskazując, że nie tylko mutacje zmiany sensu w genach niezbędnych, ale także całkowita utrata funkcji genów nieistotnych dla przeżycia może przyczyniać się do fenotypu oporności na leki. Różnice między P. berghei a P. falciparum w odniesieniu do niezbędności CRT podkreślają złożoność mechanizmów oporności na leki u różnych gatunków Plasmodium. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów może prowadzić do opracowania nowych strategii zwalczania oporności na leki przeciwmalaryczne, co jest kluczowe w kontekście globalnego zagrożenia zdrowia publicznego, jakim jest malaria.
Podsumowanie
Badania przeprowadzone na modelu mysim Plasmodium berghei dostarczyły przełomowych informacji o mechanizmach oporności na piperaquine (PPQ). Wykorzystując metodę CRISPR/Cas9, naukowcy stworzyli linie pasożytów o zwiększonym wskaźniku mutacji i zidentyfikowali pięć klonów wykazujących zmniejszoną podatność na PPQ. Analiza genomowa ujawniła pięć wspólnych mutacji, w tym kluczową mutację w genie PbCRT. Całkowite usunięcie tego genu z genomu pasożyta wykazało, że nie jest on niezbędny dla P. berghei, w przeciwieństwie do P. falciparum. Pasożyty pozbawione PbCRT wykazywały niższy poziom parasitemii i zmiany morfologiczne, ale zachowały zdolność do przeżycia. To odkrycie wskazuje na nowy mechanizm oporności na leki przeciwmalaryczne, polegający na utracie funkcji genów nieistotnych dla przeżycia, co może mieć istotne znaczenie dla rozwoju przyszłych strategii terapeutycznych.
Bibliografia
Hirai Makoto, Arai Meiji, Hayamichi Soki, Uchida Ayako, Sudo Megumi, Kubota Rie, Shinzawa Naoaki and Mita Toshihiro. Deletion of the
