Przełomowe odkrycia w badaniach nad opornością malarii na leki

Jak pasożyt malaryczny wykorzystuje PfCRT do oporności na leki?

Malaria pozostaje jedną z najbardziej wyniszczających chorób na świecie, z szacowanymi 249 milionami przypadków i 608 000 zgonów w 2022 roku. Te niepokojące statystyki pokazują, że cele Światowej Organizacji Zdrowia dotyczące redukcji zachorowań i śmiertelności pozostają nieosiągnięte. Jednym z głównych czynników utrudniających walkę z malarią jest rosnąca oporność Plasmodium falciparum na leki przeciwmalaryczne. Jak wykazano w najnowszych badaniach, pasożyt ten wykształcił co najmniej częściową oporność na niemal wszystkie stosowane przeciwko niemu leki.

Kluczowym elementem mechanizmu oporności na chloroquinę (CQ) jest białko transportowe PfCRT (Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance Transporter). To 49 kDa białko należące do nadrodziny transporterów leków/metabolitów posiada 10 transbłonowych domen helikalnych i znajduje się w wakuoli trawiennej (DV) pasożyta. Jego naturalną funkcją jest transport peptydów pochodzących z hemoglobiny do cytosolu pasożyta w celach odżywczych. Peptydy te mogą mieć długość od 4 do 11 reszt aminokwasowych i wykazują zróżnicowanie chemiczne, choć preferowane są te z ładunkiem ujemnym. Ten transport peptydów jest niezbędny dla przeżycia pasożyta – usunięcie genu PfCRT skutkuje śmiercią Plasmodium.

Naukowcy z wykorzystaniem symulacji dynamiki molekularnej (MD) zbadali, w jaki sposób mutacje w PfCRT umożliwiają transport chloroquiny i dlaczego koliduje to z naturalną funkcją transportu peptydów. Badania skupiły się na dwóch izoformach białka: wrażliwej na CQ (3D7-PfCRT) i opornej (Dd2-PfCRT). “Nasze wyniki pozwalają określić miejsca wiązania substratów, wyjaśnić polispecyficzną naturę transportu peptydów i wynikający z tego kompromis między opornością na leki a sprawnością metaboliczną pasożyta” – piszą autorzy badania.

Chloroquina działa poprzez blokowanie tworzenia kryształów hemozoniny w wakuoli trawiennej pasożyta, co prowadzi do gromadzenia się toksycznego hemu i śmierci Plasmodium. Aby dotrzeć do celu, CQ musi być transportowana do DV lub dyfundować przez błonę. Kwaśne pH w DV sprzyja protonacji leku, nadając mu ładunek +2 i uwięziając go w organelli. Mutacje w PfCRT nadają oporność, pozwalając białku transportować CQ z wakuoli trawiennej, z dala od jej miejsca działania.

Oporność na CQ po raz pierwszy pojawiła się w 1957 roku i w ciągu kolejnych dekad rozprzestrzeniła się w regionach endemicznych malarii, powodując wzrost śmiertelności. Wszystkie oporne na CQ izolaty terenowe PfCRT posiadają co najmniej 4 mutacje, a niektóre nawet dziesięć, ale wszystkie zawierają mutację K76T. Ta mutacja jest jedyną konieczną (choć niewystarczającą) dla oporności na CQ i stanowi główny marker oporności. Najczęściej występująca izoforma Dd2-PfCRT posiada 8 mutacji: M74I, N75E, K76T, A220S, Q271E, N326S, I356T i R371I. Mutacje te są głównie rozmieszczone wokół centralnej wnęki białka i zmieniają ogólny ładunek wnęki z neutralnego na ujemny.

Czy symulacje MD odsłaniają tajemnice wiązania CQ?

Co ciekawe, gdy użycie CQ zmniejszyło się z powodu szeroko rozpowszechnionej oporności, częstość występowania mutacji K76T zaczęła spadać w niektórych populacjach. Sugeruje to, że przy braku presji lekowej, oporność na CQ wiąże się z kosztem metabolicznym dla pasożyta. W eksperymentach z konkurencją wzrostu pasożytów transgenicznych z dzikim typem (wrażliwym na CQ) 3D7-PfCRT i Dd2-PfCRT, izoforma oporna na CQ przegrywa. Różnica w sprawności metabolicznej wynika prawdopodobnie ze zmienionego katabolizmu hemoglobiny w pasożytach zawierających Dd2-PfCRT i zmniejszonej zdolności białka do transportu peptydów.

Symulacje MD wykazały, że pozytywnie naładowana CQ nie przenika przez błonę, co jest zgodne z modelem uwięzienia leku w wakuoli trawiennej. Istnieją jednak znaczące różnice w dostępności wnęki białka między badanymi izoformami. CQ pobiera próbki z regionu wnęki we wszystkich trzech izoformach, ale dostęp jest znacznie korzystniejszy w Dd2-PfCRT, co potwierdza fakt, że lek spędza najwięcej czasu we wnęce Dd2-PfCRT (średnio 85,5 ± 3,4% klatek symulacji, w porównaniu do 50,0 ± 4,9% w 3D7-PfCRT) i penetruje głębiej do wnęki.

Badacze zidentyfikowali różne miejsca wiązania CQ w obu izoformach. W 3D7-PfCRT, dziesięć najlepszych pozycji znajduje się częściowo lub całkowicie poza wnęką wiążącą. Najwyżej oceniona pozycja, wraz z kilkoma innymi, znajduje się wokół pętli łączącej helisy TM 9 i 10. W przeciwieństwie do tego, pozycje klastrów w Dd2-PfCRT są bardziej rozproszone i występują głębiej we wnęce. Najwyżej oceniona pozycja pokrywa się z pozycją minimalnej energii swobodnej we wnęce Dd2-PfCRT i jest ponad dwukrotnie bardziej popularna niż następna w rankingu.

W najwyżej ocenionej pozie 3D7-PfCRT, “ogon” di-aminoalkanowy CQ znajduje się w połowie poza wnęką i jest powiązany z pętlą łączącą transbłonowe helisy 9 i 10. Reszty, które podtrzymują CQ w tej pozycji, znajdują się w bliskiej odległości od leku i wykazują różne rodzaje interakcji. Najbardziej korzystną interakcją jest wiązanie wodorowe z łańcuchem głównym Val370 przy -50 kJ mol^-1. Istnieje również wiązanie halogenowe między chlorem CQ a Glu198, interakcje elektrostatyczne między Glu372 a jednym z protonowanych azotów oraz interakcje kation-pi między grupą chinolinową a Arg371.

Odkryto, że dominującą interakcją w miejscu wiązania CQ w Dd2-PfCRT jest wiązanie elektrostatyczne między Glu198 a protonowanym azotem na grupie chinoliny, ze średnią energią potencjalną prawie -180 kJ mol^-1. Następną najbardziej korzystną interakcją przy -26 kJ mol^-1 było wiązanie halogenowe zarówno z Asp377, jak i Arg374. Istnieją również silne interakcje hydrofobowe z Gly353 i Pro354, przyczyniające się do -20 kJ mol^-1. W zależności od konformacji, występują dodatkowe wiązania wodorowe między protonowanym azotem na ogonie CQ a Gln156 lub Gln352.

Znaczenie interakcji elektrostatycznej między Glu198 a protonacją na części chinolinowej potwierdzono w dodatkowych symulacjach – gdy CQ zostało deprotonowane, szybko opuściło miejsce wiązania w ciągu 20 ns, co potwierdza znaczenie tego regionu w wiązaniu CQ z Dd2-PfCRT.

Jak mutacje PfCRT wpływają na transport peptydów?

Aby dalej zbadać rolę, jaką mutacje PfCRT mogą odgrywać w otwieraniu (lub utrudnianiu) dostępu do miejsca wiązania wzdłuż dwóch ścieżek, badacze najpierw ilościowo określili te dwie ścieżki do miejsca wiązania w powierzchni energii swobodnej Dd2-PfCRT CQ. Wzdłuż Ścieżki 1 zaobserwowano, że mutacja R371I początkowo czyni podejście do miejsca wiązania bardziej korzystnym, ale gdy CQ przechodzi przez miejsce wiązania 3D7-PfCRT CQ, następuje wzrost energii potencjalnej. W Ścieżce 2 najbardziej uderzającą zmianą jest mutacja Q271E – wprowadzenie ładunku ujemnego zwiększa energię potencjalną Ścieżki 2 średnio o -50 kJ mol^-1.

Aby zbadać, dlaczego oporność na CQ koliduje z transportem peptydów, naukowcy przeprowadzili symulacje MD z wysokimi stężeniami peptydów DPVN, PENF, PVNF lub PEEK. Peptydy DPVN, PENF i PVNF mogą uzyskać dostęp do wnęki 3D7-PfCRT przez co najmniej 65% klatek symulacji. Natomiast DPVN i PENF wykazują znaczące (p < 0,001) zmniejszenie dostępności do wnęki wiążącej Dd2-PfCRT, będąc obecnymi w średnio 17,5 ± 6,9% i 11,9 ± 4,6% klatek symulacji. Z kolei PVNF utrzymuje swoją obecność we wnęce wiążącej Dd2-PfCRT, z 60,4 ± 6,0% klatek symulacji mających peptyd znaleziony w tym miejscu.

Badacze następnie określili ilościowo najbardziej prawdopodobne miejsca wiązania peptydów 3D7-PfCRT poprzez klastrowanie pozycji peptydów, gdy znajdowały się we wnęce. Każdy z peptydów wykazywał różne zachowania wiążące; DPVN miał trzy wysoko obsadzone miejsca, PENF miał dwa, a PVNF miał tylko jedno bardzo dobrze zróżnicowane miejsce. Miejsca między peptydami różnią się pozycją i konformacją, ale wszystkie są stosunkowo centralne w wnęce 3D7-PfCRT.

Co istotne, mimo różnorodnych pozycji wiązania peptydów, badacze starali się scharakteryzować, które reszty wspierały (lub zakłócały) obecność peptydów we wnęce, niezależnie od związanej pozy. Dla wszystkich systemów peptydów 3D7-PfCRT, dodatnio naładowane reszty Lys76, Lys80 i protonowany His97 są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do korzystnych interakcji wnęki, wskazując na znaczenie komplementarności ładunku w rozpoznawaniu peptydów. Co ważne, Lys76 jest najbardziej dominującą interakcją we wszystkich trzech peptydach, pomimo różnych pozycji wiązania i rodzajów interakcji z resztą. Naturalne jest więc, że w Dd2-PfCRT, duży wkład energetyczny z Lys76 jest utracony. Lys80 staje się zamiast tego najbardziej korzystną resztą przyczyniającą się, jednak całkowita energia interakcji jest znacznie zmniejszona, wskazując na osłabione lub utracone wiązanie peptydów do tej izoformy.

Czy ewolucja PfCRT otwiera nowe możliwości terapeutyczne?

Jak sugerują badacze, mutacje w Dd2-PfCRT zmieniają ogólne środowisko elektrostatyczne wnęki, dostosowując zakres substratów, które mogą być transportowane. Rozkład właściwości chemicznych reszt i zachowanie oscylacyjne peptydów między wieloma miejscami jest bardzo przypominające to, co zaobserwowano w innych polispecyficznych białkach związanych z opornością na wiele leków, a także w transporterach anionów i kationów organicznych. Te różnorodne rodziny białek również posiadają duże wnęki z obfitością reszt hydrofobowych i okazjonalnie reszt o podobnym ładunku. Brak kierunkowości w interakcjach hydrofobowych i elektrostatycznych pozwala na przyjęcie różnych orientacji i pozycji wiązania w przestronnych wnękach transportowych.

Wpływ interakcji elektrostatycznych w pomaganiu wiązaniu polispecyficznemu wydaje się wyjaśniać różnice w zachowaniu wiązania między DPVN, PENF i PVNF. Zarówno DPVN, jak i PENF posiadają resztę łańcucha bocznego o ładunku ujemnym, co pozwala im przyjąć szereg konformacji podczas interakcji z dodatnio naładowanymi resztami we wnęce. Z tego powodu są one w stanie oscylować między miejscami, w sposób zasugerowany przez Yamaguchi i wsp. w hipotezie oscylacji wielomiejscowej. W tym przypadku liczne pozycje wiązania o niskim powinowactwie pozwalają cząsteczce oscylować, przeskakując z miejsca na miejsce, będąc nadal transportowaną z wysoką szybkością dzięki tym oscylacjom, które wszystkie występują w dużej wnęce transportowej. PVNF, będąc neutralnym i nie posiadając “destabilizującego” łańcucha bocznego o ładunku ujemnym, jest lepiej w stanie znaleźć stabilną pozycję we wnęce.

Zmieniające ładunek mutacje w Dd2-PfCRT (N75E, K76T, Q271E i R371I) czynią wnękę silnie ujemnie naładowaną. Zakres peptydów, które izoforma jest w stanie transportować, jest zmniejszony, prawdopodobnie z powodu zmniejszonej korzystności dostępu do wnęki dla peptydów o ładunku ujemnym (którymi zazwyczaj są peptydy pochodzące z hemoglobiny), jak widać w symulacjach Dd2-PfCRT z DPVN i PENF. PVNF może zatem zachować dostępność do wnęki Dd2-PfCRT ze względu na swój neutralny ładunek.

Podczas gdy zakres substratów peptydowych zmniejsza się dla Dd2-PfCRT, następuje odpowiedni wzrost zakresu cząsteczek leków, które jest w stanie transportować. Dd2-PfCRT może transportować szereg związków przeciwmalarycznych, takich jak chinina, amodiachina, meflochina, lumefantryna i piperaquina, oprócz leków nie-przeciwmalarycznych, takich jak werapamil. Leki przeciwmalaryczne mają wspólną grupę chinolinową i są dodatnio naładowane przy pH DV. Początkowo można by pomyśleć, że zwiększony zakres substratów jest pośredniczony przez wspólne grupy chemiczne leków mające wspólne miejsce wiązania. Jednak z badań kinetycznych i symulacji MD wiemy, że przynajmniej piperaquina i chinina posiadają odrębne tryby wiązania do CQ.

Jak odkrycia PfCRT wpływają na przyszłość terapii malarii?

Badacze sugerują interpretację ewolucji Dd2-PfCRT – mutacje przywłaszczyły sobie podstawową polispecyficzność 3D7-PfCRT i dostroiły zakres substratów, które mogły być transportowane, zmieniając ogólne środowisko elektrostatyczne wnęki. Zasada ta została zademonstrowana w badaniach mutagenezy innych białek oporności wielolekowej. To być może dlatego mutacje Dd2-PfCRT nie tworzą aktywnie nowego miejsca wiązania dla CQ, ale po prostu pozwalają mu wejść i związać się z resztami, które były już obecne w 3D7-PfCRT, przejmując podstawowy mechanizm wiązania polispecyficznego.

Czy wyniki te mogą prowadzić do nowych strategii terapeutycznych? PfCRT jako białko niezbędne dla pasożyta i odgrywające centralną rolę w modulowaniu wrażliwości na leki, może być potencjalnym celem działania przeciwmalarycznego i “odwrócenia oporności”. Identyfikacja trybów wiązania CQ i kilku substratów peptydowych może stanowić podstawę racjonalnego, opartego na strukturze projektowania inhibitorów. Jednak polispecyficzny mechanizm rozpoznawania peptydów zidentyfikowany w tym badaniu może nakazywać ostrożność w tym podejściu.

Projektowane inhibitory powinny celować w kluczowe reszty wiążące peptydy: Lys76, Lys80, His97, Phe145, Leu148, Gln156 i Leu160, ponieważ może to utrudniać ewolucję oporności, zgodnie z hipotezą otoczki substratu. Badania funkcjonalne mutacji w tych resztach powinny być najpierw przeprowadzone w celu potwierdzenia hipotetycznego regionu wiązania peptydów.

Badacze zaobserwowali, że miejsce wiązania CQ jest blokowane przez Lys76, i z tego powodu musi wystąpić wiele stopniowych mutacji, aby pasożyt mógł przywrócić swoją sprawność metaboliczną. Chociaż generalnie powoduje to znaczny koszt metaboliczny u pasożytów opornych na CQ (przy braku presji lekowej), izoforma Cam734-PfCRT (M74I, N75D, K76T, A144F, L148I, I194T, A220S, Q271E, T333S) już ewoluowała w sposób umożliwiający obejście tego problemu. Mutacje A144F i L148I znajdują się w (lub w pobliżu) hipotetycznego głównego regionu wiązania peptydów, prawdopodobnie przywracając transport peptydów poprzez zwiększenie interakcji hydrofobowych, jednocześnie nadal zmieniając ładunki za pomocą N75D, K76T i Q271E, aby umożliwić transport leków.

Badanie to dostarcza cennych informacji na temat molekularnych podstaw polispecyficznego wiązania peptydów i leków przez PfCRT oraz dlaczego te funkcje są wzajemnie niekompatybilne. Potwierdza długotrwałe hipotezy dotyczące centralnej roli, jaką K76 odgrywa w zdolności transportowej białka. Protokół symulacji jest solidny i zgodny z danymi eksperymentalnymi, co otwiera potencjalną drogę do racjonalnego, opartego na strukturze projektowania inhibitorów PfCRT.

Jakie są implikacje kliniczne tych odkryć? Zrozumienie mechanizmów oporności na poziomie molekularnym może pomóc w opracowaniu nowych leków przeciwmalarycznych lub strategii mających na celu przywrócenie skuteczności istniejących leków. Może również pomóc w przewidywaniu, które kombinacje leków będą najbardziej skuteczne przeciwko szczepom opornym na chloroquinę, co jest kluczowe dla skutecznego leczenia w regionach, gdzie oporność jest powszechna.

Co więcej, zrozumienie kosztów metabolicznych związanych z opornością na leki może pomóc w opracowaniu strategii, które wykorzystują te słabości pasożyta. Na przykład, cykliczne stosowanie różnych leków przeciwmalarycznych mogłoby potencjalnie wykorzystać koszt metaboliczny oporności, aby utrzymać skuteczność leków przez dłuższy czas.

Podsumowanie

Badania nad białkiem transportowym PfCRT (Plasmodium falciparum Chloroquine Resistance Transporter) wyjaśniają mechanizm oporności pasożyta malarycznego na leki przeciwmalaryczne. Naturalna funkcja tego białka polega na transporcie peptydów z wakuoli trawiennej do cytosolu pasożyta. Mutacje w PfCRT, szczególnie kluczowa mutacja K76T, umożliwiają transport chloroquiny i innych leków z wakuoli trawiennej, co prowadzi do oporności. Te zmiany wiążą się jednak z kosztem metabolicznym dla pasożyta, zmniejszając jego zdolność do transportu peptydów. Symulacje dynamiki molekularnej wykazały różnice w wiązaniu chloroquiny między wrażliwą (3D7-PfCRT) a oporną (Dd2-PfCRT) izoformą białka. Mutacje zmieniają środowisko elektrostatyczne wnęki białka, wpływając na zakres transportowanych substratów. Te odkrycia otwierają nowe możliwości w projektowaniu leków i strategii terapeutycznych w walce z malarią, szczególnie w kontekście rosnącej oporności na obecnie stosowane leki.

Bibliografia

Tanner John D., Richards Sashika N. and Corry Ben. Molecular basis of the functional conflict between chloroquine and peptide transport in the Malaria parasite chloroquine resistance transporter PfCRT. Nature Communications 2025, 16, 431-454. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-58244-0.