Rewolucyjna metoda badania genów w malarii – nowe możliwości terapeutyczne

Jakie rewolucyjne metody badań genów w malarii wprowadzają nowe terapie?

Przełomowa metoda badania funkcji genowych w malarii może otworzyć drogę do nowych terapii blokujących transmisję choroby. Naukowcy opracowali innowacyjną strategię wykorzystującą system CRISPR-Cas9 z mechanizmem homing gRNA, który umożliwia jednoczesne badanie funkcji wielu genów w diploidalnych stadiach rozwoju pasożyta Plasmodium.

Malaria, choroba przenoszona przez samice komarów z rodzaju Anopheles, wciąż stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując śmierć ponad 608 000 osób rocznie (dane WHO z 2022 r.), głównie dzieci poniżej 5. roku życia. Mimo że dotychczasowe strategie kontroli, takie jak moskitiery nasączone insektycydami i opryski wewnątrzdomowe, zapobiegły 68% przypadków malarii między 2000 a 2015 rokiem, pojawienie się komarów odpornych na insektycydy i pasożytów odpornych na leki doprowadziło do odwrócenia tego pozytywnego trendu. “Dane te podkreślają konieczność opracowania nowych strategii zwalczania transmisji malarii, co z kolei wymaga głębszego zrozumienia mechanizmów biologicznych leżących u podstaw tego procesu” – piszą autorzy badania.

Głównym wyzwaniem w badaniu funkcji genowych w Plasmodium jest fakt, że po zapłodnieniu pasożyt przechodzi przez stadium diploidalne, w którym tradycyjne metody badawcze mają ograniczoną skuteczność. W cyklu życiowym Plasmodium, haploidalne pasożyty namnażają się bezpłciowo w erytrocytach, powodując objawy choroby. Transmisja rozpoczyna się, gdy komary Anopheles pobierają krew zawierającą seksualne prekursory – gametocyty. W odpowiedzi na bodźce środowiskowe, gametocyty dojrzewają szybko do haploidalnych gamet, które zapładniają się, tworząc diploidalną zygotę. Zygota replikuje swój genom i przechodzi mejozę, tworząc funkcjonalnie tetraploidalnego ookineta, w którym wszystkie cztery produkty mejozy pozostają w tej samej otoczce jądrowej.

Jak technologia CRISPR-Cas9 zmienia badania pasożyta malaria?

Naukowcy opracowali innowacyjne rozwiązanie tego problemu, tworząc dwie linie pasożytów – jedną produkującą wyłącznie gametocyty męskie, a drugą wyłącznie żeńskie. W tym celu wykorzystali znane geny female development 1 (fd1) oraz male development 4 (md4), które pełnią funkcje specyficzne dla płci we wczesnej gametocytogenezie. Następnie wyposażyli te linie w system edycji genetycznej oparty na CRISPR-Cas9, który umożliwia wprowadzenie modyfikacji genetycznych po zapłodnieniu.

W eksperymencie potwierdzającym skuteczność metody, badacze wykorzystali białka fluorescencyjne (GFP i mCherry) do oznaczenia genu MyoA. Skrzyżowanie linii z różnymi markerami fluorescencyjnymi, z których jedna dodatkowo wyrażała gRNA celujące w sekwencję mCherry, doprowadziło do “przełączenia kolorów” – oocysty, które normalnie byłyby żółte (ekspresja obu białek), stały się zielone, co świadczy o skutecznej edycji genetycznej. Efektywność tego procesu wynosiła imponujące 97%, gdy gRNA pochodziło z gamety żeńskiej, i 89%, gdy dostarczała go gameta męska.

Aby przetestować skalowalność metody, naukowcy przeprowadzili pilotowy screening 21 genów, wykorzystując barcodowane wektory knockout z zasobów PlasmoGEM (Plasmodium Genetic Modification). Wektory te zostały wyposażone w ekspresję gRNA, co umożliwiło jednoczesne badanie funkcji wielu genów. Geny docelowe zostały wybrane tak, aby były redundantne w aseksualnych stadiach krwi i aby dawały szereg znanych fenotypów w celu oceny systemu. Włączono co najmniej trzy cele dla każdego etapu cyklu życiowego. Dodatkowo zbadano osiem mniej poznanych genów, których wzorce transkrypcji wskazywały na prawdopodobne funkcje w funkcjonalnie diploidalnych stadiach komara.

Wyniki screeningu potwierdziły znane wcześniej funkcje niektórych genów, takich jak ap2-o4, ale co ważniejsze, doprowadziły do odkrycia nowej funkcji genu kodującego białko podobne do transportera oporności na chlorochinę (CRTL). Badacze podkreślają, że skuteczność ich metody w identyfikacji nowych funkcji genowych jest wysoka, co potwierdzają wyniki pilotowego screeningu. Oocyst conversion rate (wskaźnik konwersji oocystów) był analizowany dla każdego z badanych genów, a następnie normalizowany względem genów o znanej funkcji w wątrobie, ale nie w oocystach.

Jak można było przewidzieć, mutanty z defektami w płodności męskiej, takie jak kinaza aktywowana mitogenem 2, były zubożone wśród oocystów niezależnie od zdolności wektora do homing. Natomiast dla innych genów wektory homing powodowały znaczne redukcje w barcodach oocystów w porównaniu z ich odpowiednikami bez homing. W przypadku czynnika transkrypcyjnego ap2-o4, na przykład, obecność gRNA spowodowała 64-krotne zmniejszenie, co jest zgodne z jego znaną istotną rolą między formowaniem ookinetu a oocystem. Podobnie dane ze screeningu dla reduktazy glutationowej (gr) i wydzielanego białka adhezyjnego ookinetu (soap) odtwarzały znane fenotypy sklonowanych mutantów, które wcześniej nie były widoczne w screeningach PlasmoGEM.

“Podsumowując, stwierdzamy, że jedynym genem, dla którego pilotowy screening jest niezgodny z opublikowaną wiedzą, jest pank2, oraz że zarówno wskaźnik drop-out, jak i wskaźnik fałszywie ujemnych wyników tej technologii są akceptowalne dla przyszłego rozszerzenia podejścia screeningowego” – konkludują badacze.

Jaką rolę odgrywa białko CRTL w rozwoju oocyst?

Szczegółowa analiza funkcji CRTL wykazała, że białko to jest niezbędne dla prawidłowego rozwoju oocyst. Aby zrozumieć rolę CRTL w stadiach komara, badacze najpierw połączyli C-końcowy potrójny epitop HA z endogennym genem, aby monitorować ekspresję i lokalizację białka. Analiza Western blot sugeruje brak CRTL w aseksualnych stadiach krwi, ale białko fuzyjne pełnej długości (132 kDa) zostało wykryte w ookinetach, co jest zgodne z najwyższym poziomem mRNA w ookinetach według Malaria Cell Atlas. Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła brak ekspresji CRTL zarówno w stadiach aseksualnych, jak i seksualnych, ujawniając małą liczbę słabo znakowanych ognisk, które pojawiły się po raz pierwszy w cytoplazmie ookinetu.

Przebieg czasowy rozwoju oocystów wykrył CRTL-HA od 2 dnia, gdzie znakowanie współlokalizowało się z wysoce załamującymi światło kryształami pigmentu malarii. “W oocystach granulki pigmentu tworzą charakterystyczne wzory i są silnie załamujące światło, gdy obserwuje się je w mikroskopie kontrastowo-fazowym lub w świetle spolaryzowanym” – wyjaśniają badacze. “Są one cechą definiującą oocyst, pozwalającą mikroskopistom rozpoznać nawet małe cysty i odróżnić je od komórek jelita środkowego komara”.

Mutanty pozbawione tego genu tworzyły oocysty, które przestawały rosnąć około 8 dnia po infekcji i wykazywały charakterystyczną wakuolizację. Mikroskopia elektronowa potwierdziła, że mniejsze oocysty mutantów zawierały wakuole o średnicy około 1 μm i nie wykazywały oznak sporulacji, w przeciwieństwie do oocystów typu dzikiego, w których widoczne były sporoblasty i formujące się sporozoity.

W eksperymencie czasowym oocysty mutantów przestawały rosnąć od 8. dnia. Do 18. dnia oocysty typu dzikiego urosły do ponad dwukrotności średnicy oocystów mutantów. W dniu, w którym wzrost był po raz pierwszy zmniejszony, oocysty mutantów rozpoczęły replikację DNA podobnie jak typ dziki, ale charakteryzowały się okrągłymi wakuolami, które wykluczały cytoplazmatyczne białko mCherry. Do 10. dnia praktycznie wszystkie oocysty mutantów wykazywały wakuolizację.

Obrazowanie poklatkowe wykazało ruchy Browna kryształów pigmentu wewnątrz wakuoli, sugerując, że wakuolizacja wynika z pęcznienia DV. W oocystach typu dzikiego kryształy pigmentu współlokalizowały się z LysoTracker, co jest zgodne z ich umiejscowieniem wewnątrz kwaśnego przedziału. Natomiast wakuole oocystów mutantów nie barwiły się LysoTrackerem, sugerując, że pęcznieniu DV towarzyszy utrata zakwaszenia.

Aby dodatkowo potwierdzić lokalizację CRTL w wakuoli trawiennej (DV) w oocyście, badacze zbadali lokalizację znanego markera DV, białka wakuolarnego pasożytniczego 1 (PV1), w oocyście. W przeciwieństwie do CRTL, PV1 jest ekspresjonowane zarówno w stadiach krwi, jak i w oocyście. W stadiach krwi PV1 jest obecne w wakuoli pasożytniczej i w zawierającej pigment wakuoli trawiennej schizontu. Podobnie jak CRTL, PV1 lokalizuje się w zawierającej pigment DV w oocyście, dostarczając dodatkowego potwierdzenia lokalizacji CRTL w DV w oocyście.

Czy struktura PbCRTL podpowiada nowe cele terapeutyczne?

Modelowanie strukturalne wykazało, że PbCRTL ma budowę charakterystyczną dla transporterów metabolitów leków (DMT), podobną do transportera oporności na chlorochinę z Plasmodium falciparum (PfCRT). Używając FoldSeek, najbliższą strukturą eksperymentalną do PBANKA_0916000 jest transporter oporności na chlorochinę z Plasmodium falciparum (PfCRT). Rzeczywiście, nałożenie przewidywania AF2 i PfCRT wykazuje wysoki stopień podobieństwa strukturalnego z odchyleniem średniokwadratowym wynoszącym 2,9 Å. Przewidywana przez AF2 struktura CRTL składa się z dziesięciu helis transmembranowych ułożonych w pary antyrównoległe, podobnie jak CRT.

Oprócz rdzenia fałdu DMT, białko PbCRTL ma rozległe pętle i ogony z wewnętrznie nieuporządkowanymi domenami (IDR). Takie regiony pozamembranowe nie są wymagane do transportu i najbardziej prawdopodobne jest, że CRTL tworzy kompleks z innymi białkami, które regulują jego aktywność. Podobieństwo między PbCRTL a PfCRT jest głównie strukturalne. PfCRT (424 aminokwasy) wyrównuje się z C-końcem PbCRTL (1113 aminokwasów), wykazując 18,1% identyczności i 32,7% podobieństwa w sekwencjach aminokwasów.

N-koniec PbCRTL, który jest bogaty w asparaginę i lizynę, nie stanowi części przewidywanej domeny transporterowej. W przeciwieństwie do tego, synteniczne ortologi P. berghei i P. falciparum są znacznie bardziej podobne, z 65,2% identycznością i podobieństwem w przypadku CRT oraz 34,7% identycznością i 47,1% podobieństwem w przypadku CRTL. OrthoDB identyfikuje homologi CRTL we wszystkich gatunkach Plasmodium, ale nie w innych Apicomplexa.

Różnice w potencjale elektrostatycznym między tymi białkami sugerują jednak, że mogą one transportować różne substraty – podczas gdy PfCRT transportuje dodatnio naładowaną chlorochinę, CRTL może być zaangażowany w transport ujemnie naładowanych metabolitów, być może z hydrofobowym przedłużeniem, jak ATP.

Jak rola wakuoli trawiennej wpływa na rozwój oocyst?

Autorzy badania podkreślają, że pobieranie składników odżywczych przez oocyst jest słabo poznane, a rola jego wakuoli trawiennej wymaga dalszego zbadania. Pasożyty w stadium krwinkowym pobierają hemoglobinę z cytoplazmy komórki gospodarza i rozkładają ją proteolitycznie w kwaśnym środowisku DV. Grupa prostetyczna, hem, jest utleniana do ferriprotoporfiryny IX i detoksykowana przez sekwestrację jako mikrokryształy hemozoniny, proces, który jest celem CQ i innych przeciwmalarycznych chinolin.

“Oocysty dziedziczą kryształy hemozoniny z makrogametocytu i kuszące jest spekulowanie, że główną funkcją ich DV może być zapobieganie uwalnianiu toksycznego hemu z zawartych w nich kryształów hemozoniny” – sugerują badacze. “Barwienie LysoTrackerem pokazuje, że DV oocystów są zakwaszone, co sprzyjałoby samoasocjacji hemu. Odkwaszone DV w mutancie CRTL mogłyby zatem prowadzić do uwolnienia toksycznego hemu, co może uniemożliwić dalszy wzrost oocystów.”

Czy transportery leków to nowe cele w walce z malarią?

Wykazano, że PfCRT eksportuje podwójnie naładowany jon chlorochiny (CQ2+) wykorzystując skierowany na zewnątrz gradient H+ w DV stadium aseksualnego krwinkowego. Dostępna struktura PfCRT została uchwycona z jamą otwartą na wakuolę trawienną, ujawniając wysoce ujemnie naładowaną kieszeń do wiązania CQ2+. Chociaż zaproponowano, że naturalnym substratem dla PfCRT mogą być peptydy pochodzące od gospodarza o długości 4-11 reszt, kinetyka wychwytu w oocytach Xenopus jest powolna i wymaga jeszcze walidacji przy użyciu oczyszczonych składników.

Podobnie jak homologi bakteryjne, wykazano również, że oczyszczony PfCRT rekonstytuowany w liposomach może eksportować dodatnio naładowane aminokwasy, takie jak arginina, z szybkościami transportu, które wydają się bardziej zgodne z substratem fizjologicznym. W przeciwieństwie do PfCRT, jama PbCRTL ma zarówno regiony niepolarne, jak i dodatnio naładowane, wskazując, że jego substratem jest raczej ujemnie naładowany metabolit, być może z hydrofobowym przedłużeniem, np. ATP.

Jakie kliniczne szanse niesie nowe podejście do transmisji malarii?

Jakie są kliniczne implikacje tych odkryć? Identyfikacja genów niezbędnych dla rozwoju pasożyta w komarze może prowadzić do opracowania leków lub szczepionek, które blokują transmisję malarii. Takie interwencje byłyby szczególnie cenne w kontekście rosnącej oporności na obecne leki przeciwmalaryczne. Ponadto, lepsze zrozumienie biologii Plasmodium może pomóc w opracowaniu bardziej skutecznych strategii kontroli wektorów.

Badacze konkludują, że ich skalowalna nowa strategia screeningowa może prowadzić do systematycznego odkrywania istotnych genów transmisji malarii, których pierwsze niezbędne funkcje pojawiają się po zapłodnieniu, umożliwiając tym samym ocenę ich potencjału jako celów dla interwencji blokujących transmisję. “Podczas gdy bardziej rozbudowany przyszły screening tego typu może systematycznie badać, czy zmiany metaboliczne, takie jak przełączenie metabolizmu mitochondrialnego na fosforylację oksydacyjną, są potrzebne już w ookinecie, czy także później, w oocyście” – sugerują autorzy.

Czy wyniki tego badania mogą zmienić podejście do diagnostyki i leczenia malarii? Jakie wyzwania mogą pojawić się przy wdrażaniu terapii ukierunkowanych na blokowanie transmisji? Te pytania pozostają otwarte i będą wymagały dalszych badań, ale opracowana metoda stanowi ważny krok w kierunku lepszego zrozumienia biologii Plasmodium i opracowania nowych strategii zwalczania malarii.

Podsumowanie

Naukowcy opracowali przełomową metodę badania funkcji genowych w malarii, wykorzystując system CRISPR-Cas9 z mechanizmem homing gRNA. Technologia ta umożliwia jednoczesne badanie wielu genów w diploidalnych stadiach rozwoju pasożyta Plasmodium. W badaniach wykorzystano dwie linie pasożytów produkujących wyłącznie gametocyty męskie lub żeńskie, co pozwoliło na skuteczną edycję genetyczną po zapłodnieniu. Pilotowy screening 21 genów potwierdził skuteczność metody i doprowadził do odkrycia nowej funkcji genu kodującego białko CRTL. Szczegółowa analiza wykazała, że CRTL jest niezbędne dla prawidłowego rozwoju oocyst i zlokalizowane jest w wakuoli trawiennej. Modelowanie strukturalne ujawniło podobieństwo CRTL do transporterów metabolitów leków. Odkrycia te otwierają nowe możliwości w opracowaniu terapii blokujących transmisję malarii, szczególnie w kontekście rosnącej oporności na obecne leki przeciwmalaryczne.